Generere transposon innsetting biblioteker i Gram-negative bakterier for høy gjennomstrømning sekvensering

Summary

Vi beskriver en metode for å generere mettende transposonmutantbiblioteker i Gram-negative bakterier og påfølgende fremstilling av DNA amplicon biblioteker for høy gjennomstrømning sekvensering. Som et eksempel fokuserer vi på ESKAPE-patogenet, Acinetobacter baumannii,men denne protokollen er mottagelig for et bredt spekter av Gram-negative organismer.

Abstract

Transposon sekvensering (Tn-seq) er en kraftig metode som kombinerer transposon mutagenese og massiv parallell sekvensering for å identifisere gener og veier som bidrar til bakteriell fitness under et bredt spekter av miljøforhold. Tn-seq-applikasjoner er omfattende og har ikke bare aktivert undersøkelse av genotype-fenotyperelasjoner på organismenivå, men også på befolknings-, samfunns- og systemnivå. Gram-negative bakterier er sterkt forbundet med antimikrobielle resistensfenotyper, som har økt tilfeller av antibiotikabehandlingssvikt. Antimikrobiell resistens er definert som bakteriell vekst i nærvær av ellers dødelige antibiotika. Den “siste-linje” antimikrobielle colistin brukes til å behandle Gram-negative bakterielle infeksjoner. Imidlertid kan flere Gram-negative patogener, inkludert Acinetobacter baumannii utvikle colistinresistens gjennom en rekke molekylære mekanismer, hvorav noen ble karakterisert ved hjelp av Tn-seq. Videre varierer signaltransduksjonsveier som regulerer colistinresistens i Gram-negative bakterier. Her foreslår vi en effektiv metode for transposon mutagenese i A. baumannii som effektiviserer generering av et mettende transposon innsettingsbibliotek og amplicon bibliotekkonstruksjon ved å eliminere behovet for begrensningsenzymer, adapter ligation og gelrensing. Metodene som er beskrevet her, vil muliggjøre grundig analyse av molekylære determinanter som bidrar til A. baumannii fitness når de utfordres med colistin. Protokollen gjelder også for andre Gram-negative ESKAPE patogener, som primært er forbundet med legemiddelresistente sykehusinfeksjoner.

Introduction

Oppdagelsen av antibiotika er utvilsomt en av de mest virkningsfulle^th helserelaterte hendelsene i det 20. Ikke bare løser antibiotika raskt alvorlige bakterielle infeksjoner, de spiller også en avgjørende rolle i moderne medisin. Store operasjoner, transplantasjoner og fremskritt i neonatal medisin og kjemoterapi la pasienter utsatt for livstruende infeksjoner og disse terapiene ville ikke være mulig uten antibiotika^1,2. Imidlertid har rask utvikling og spredning av antibiotikaresistens blant menneskelige patogener betydelig redusert effekten av alle klinisk viktige klasser av antibiotika³. Mange bakterielle infeksjoner som en gang var lett ryddet med antibiotikabehandling, reagerer ikke lenger på klassiske behandlingsprotokoller, noe som forårsaker en alvorlig trussel mot global folkehelse¹. Antimikrobiell resistens (AMR) er der bakterielle celler vokser i ellers dødelige konsentrasjoner av antibiotika, uavhengig av behandlingsvarighet^4,5. Det er et presserende behov for å forstå molekylære og biokjemiske faktorer som regulerer AMR, noe som vil bidra til å veilede alternativ antimikrobiell utvikling. Spesielt er ESKAPE patogener problematiske i kliniske omgivelser og forbundet med omfattende AMR. Disse inkluderer Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa og Enterobacter spp. Mens flere mekanismer bidrar til AMR i ESKAPE patogener, er de siste fire organismene Gram-negative.

Gram-negative bakterier monterer en definerende ytre membran som beskytter dem mot ugunstige miljøforhold. Den ytre membranen fungerer som en permeabilitetsbarriere for å begrense oppføring av giftige molekyler, som antibiotika, inn i cellen. I motsetning til andre biologiske membraner er den ytre membranen asymmetrisk. Det ytre pakningsvedlegget er beriket med overflateksponert lipopolysakkarid, mens det indre pakningsvedlegget er en blanding av fosfolipider⁶. Lipopolysakkaridmolekyler er forankret til den ytre membranen av en konservert lipid A moiety innebygd i lipid bilayer⁷. Den kanoniske lipid Et domene av Escherichia coli lipopolysakkarid er nødvendig for veksten av de fleste Gram-negative bakterier og syntetiseres av en ni-trinns enzymatisk vei som er en av de mest grunnleggende og bevarte banene i Gram-negative^{organismer 6,7,8}.

Polymyxiner er kationiske antimikrobielle peptider som retter seg mot lipid et domene av lipopolysakkarid for å perturb den ytre membranen og lyse cellen. Den elektrostatiske interaksjonen mellom positivt ladede rester av polymyxiner og de negativt ladede lipid A fosfatgruppene forstyrrer bakteriecellemembranen som til slutt fører til^{celledød 9,10,11,12,13}. Colistin (polymyxin E) er en siste-resort antimikrobiell brukes til å behandle infeksjoner forårsaket av multidrug resistente Gram-negative nosocomial patogener, som Acinetobacter baumannii^14,15,16. Først oppdaget i 1947, polymyxiner er produsert av jordbakterier, Paenibacillus polymyxa^17,18,19. Polymyxiner ble foreskrevet for å behandle Gram-negative infeksjoner i mange år før deres kliniske bruk var begrenset på grunn av rapporter om signifikant nefro- og nevrotoksisitet^20,21.

A. baumannii er et nosocomial Gram-negativt patogen som har dramatisk økt sykeligheten og dødeligheten av pasientutfall de siste^{tiårene 22}. Det som en gang ble ansett som et lavtrusselpatogen, utgjør nå en betydelig risiko for sykehusinfeksjon over hele verden på grunn av sin utrolige evne til å skaffe AMR og høy risiko for^{epidemi 23,24}. A. baumannii står for mer enn 10% av nosocomial infeksjoner i USA. Sykdom manifesterer seg som lungebetennelse, bakteriemi, urinveisinfeksjoner, hud- og bløtvevsinfeksjoner, meningitt og endokarditt²⁵. Behandlingstilbud for A. baumannii infeksjoner har sunket på grunn av motstand mot nesten alle antibiotikaklasser, inkludert β-lactams, fluorokinoloner, tetracyklin og aminoglykosider^23,24. Utbredelsen av multiresistente, omfattende legemiddelresistente og panresistente A. baumannii-isolater har ført til en oppblomstring i colistinbehandling, som ble antatt å være et av de få gjenværende terapeutiske alternativene som fortsatt er effektive mot multiresistentE A. baumannii. Imidlertid har økt colistin motstand blant A. baumannii isolater ytterligere forsterket sin trussel mot den globale^{folkehelsen 10,11,12,13,27,30,31}.

Nylige fremskritt innen sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning, som transposonsekvensering (Tn-seq), har gitt viktige verktøy for å fremme vår forståelse av bakteriell fitness in vitro og in vivo. Tn-seq er et kraftig verktøy som kan utnyttes til å studere genotype-fenotype interaksjoner i bakterier. Tn-seq er bredt anvendelig på tvers av bakterielle patogener, hvor den kombinerer tradisjonell transposon mutagenese med massiv parallell sekvensering for raskt å kartlegge innsettingssteder, som kan brukes til å koble DNA-mutasjoner til fenotypiske varianter på en genom-wide skala^{32,,33,,34,,35}. Mens transposon mutagenesis metoder har tidligere blitt beskrevet, de generelle trinnene er lik³³. For det første genereres et innsettingsbibliotek ved hjelp av transposon mutagenese, hvor hver bakteriell celle i en populasjon er begrenset til en enkelt transposoninnsetting i det genomiske DNA (gDNA). Etter mutagenese er individuelle mutanter samlet. gDNA ekstraheres fra innsettingmutantbassenget, og transposonkryssene forsterkes og utsettes for sekvensering med høy gjennomstrømning. Leser representerer innsettingsområder, som kan tilordnes genomet. Transposon innsettinger som reduserer fitness raskt faller ut av befolkningen, mens gunstige innsettinger er beriket. Tn-seq har vært medvirkende til å fremme vår forståelse av hvordan gener påvirker bakteriell kondisjon i stress³³.

Himar1 mariner transposon system kodet i pJNW684 ble spesielt konstruert og optimalisert for formålet med transposon mutagenesis. Det inkluderer en mariner-familietransposon flankerer kanamycin motstand genet, som brukes til valg av transposon innsetting mutanter i A. baumannii. Den koder også en A. baumannii-spesifikk promotor som driver uttrykk for transposasekodingsgenet³⁶. Den marinerbasertetransposon inneholder også to translasjonelle terminatorer nedstrøms av kanamycinresistensgenet, som forhindrer gjennomlesning nedstrøms av innsetting³⁷. pJNW684 bærer også en RP4/oriT/oriR6K-betinget opprinnelse av replikering som krever at λpir-genet som donorstammen bidrar med, replikerer³⁸. I fravær av λpir genet, pJNW684 vektor bærer transposition maskiner vil ikke være i stand til å replikere i A. baumannii mottaker stamme^10,,36,,38. Derfor, under bakteriell bøyning, settes bare transposonet inn i mottakergenomet uten bakgrunnsinnsetting av plasmiden, som bærer transposasegenet. Dette er viktig fordi tapet av transposaseaktivitet sammen med plasmid resulterer i enkelt, stabil transposisjonshendelse som hindrer transposonet fra å flytte til forskjellige steder når den setter seg inn i mottakergenomet.

pJNW648 har også blitt testet for aktivitet i en annen Gram-negativ organisme, E. coli. Vellykket montering av et mettende Tn-seq bibliotek i E. coli stamme W3110 indikerte at systemet er mottagelig for å utføre mutagenese i et bredt spekter av patogener, inkludert Enterobacteriaceae. Videre kan A. baumannii spesifikke arrangør som driver transposase uttrykk raskt utveksles med en arts-spesifikk promotor. Til slutt kan kanamycinresistensgenet byttes mot andre motstandskassetter, avhengig av AMR-fenotypen til organismen som studeres.

En faktor som bidrar til kolitinresistens i A. baumannii er administrasjon av utilstrekkelige doser, hvor bakterier utsettes for selektivt trykk ved ikke-dødelige nivåer³⁹. Flere rapporter viste at subinhibitory antimikrobielle konsentrasjoner kan indusere regulerte responser som endrer cellefysiologi for å redusere mottakeligheten til hele^{bakteriepopulasjonen 11,,12,,30,,31}. Ved hjelp av Tn-seq oppdaget vi faktorer som regulerer colistinresistens i A. baumannii-stammen ATCC 17978 etter eksponering for hemmende¹⁰ og subinhibitory konsentrasjoner av colistin. Dette eksemplet beskriver en Tn-seq metode som effektiviserer konstruksjon og berikelse av en mettet transposon mutant bibliotek ved hjelp av mariner-basertefamilien av transposoner^40,41. Mens flere Tn-seq protokoller generere 20.000 – 100.000 mutanter^{35,,42,,43,,44,,45,,46}, protokollen beskrevet her kan raskt generere en transposon bibliotek på 400.000 + mutanter, som omtrent tilsvarer en transposon innsetting hver 10-base par i A. baumannii¹⁰. Videre kan bibliotekstørrelsen skaleres opp uten betydelig ekstra innsats. Denne metoden eliminerer også kravet om begrensning endonucleases, adapter ligation og gel rensing, noe som kan redusere endelig bibliotek mangfold.

Protocol

1. Bakteriell belastning forberedelse Strek “donor” belastning (E. coli MFD DAP-/ pJNW684, Table of Materials) for isolerte kolonier på Luria-Bertani agar supplert med 600 μM diaminopisyre (DAP), 100 mg / L ampicillin og 25 mg / L kanamycin. Inkuber over natten ved 37 °C. Ved hjelp av en enkelt isolert koloni, inokulere 50 ml Luria kjøttkraft (LB) supplert med 600 μM DAP, 100 mg / L av ampicillin og 25 mg / L kanamycin i en 250 ml Erlenmeyer kolbe og merk den som “dono…

Representative Results

De skisserte metodene beskriver genereringen av et transposonbibliotek med høy tetthet i A. baumannii-stammen ATCC 17978 gjennom bakteriell bøyning ved hjelp av E. coli MFD DAP-, som replikerer plasmid pJNW684 (figur 4B). Den detaljerte protokollen bruker to-foreldre bakteriell bøyning for overføring av pJNW684 fra E. coli λpir+ donor belastning til A. baumannii mottaker belastning. Dette er en effektiv og billig metode for å gen…

Discussion

A. baumannii er en fremvoksende trussel mot global folkehelse på grunn av rask oppkjøp av AMR mot “siste linje” terapeutiske midler, for eksempel colistin^{10,11,12,23,24,30,31}. I de siste tiårene har Tn-seq spilt en kritisk rolle i å belyse genotype-fenotype interaksjoner på tve…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875