Modèle de cicatrisation des plaies excisional murine et analyse histologique des plaies morphométriques

Summary

Ce protocole décrit comment générer des blessures excisionnelles bilatérales et pleine épaisseur chez la souris et comment surveiller, récolter et préparer les plaies pour l’analyse morphométrique. On y trouve une description détaillée de la façon d’utiliser les sections histologiques périodiques pour définir, quantifier et détecter avec précision les défauts morphométriques.

Abstract

Le modèle de blessure excisional murine a été employé intensivement pour étudier chacune des phases séquentiellement superposées de la guérison de blessure : inflammation, prolifération et remodelage. Les plaies murines ont un lit de plaie histologiquement bien défini et facilement reconnaissable sur lequel ces différentes phases du processus de guérison sont mesurables. Sur le terrain, il est courant d’utiliser un « milieu » arbitrairement défini de la plaie pour des analyses histologiques. Cependant, les blessures sont une entité tridimensionnelle et souvent pas histologically symétrique, soutenant la nécessité d’une méthode bien définie et robuste de quantification pour détecter des défauts morphométriques avec une petite taille d’effet. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour créer des plaies excisionnelles bilatérales de pleine épaisseur chez la souris ainsi qu’une instruction détaillée sur la façon de mesurer les paramètres morphométriques à l’aide d’un programme de traitement d’image sur certaines sections de série. Les mesures en deux dimensions de la longueur de la plaie, de la longueur épidermique, de la zone épidermique et de la zone de la plaie sont utilisées en combinaison avec la distance connue entre les sections pour extrapoler la zone épidermique à trois dimensions couvrant la plaie, la zone globale de la plaie, le volume épidermique et le volume des plaies. Bien que cette analyse histologique détaillée soit plus longue et plus gourmande en ressources que les analyses conventionnelles, sa rigueur augmente la probabilité de détecter de nouveaux phénotypes dans un processus intrinsèquement complexe de cicatrisation des plaies.

Introduction

La cicatrisation cutanée des plaies est un processus biologique complexe dont les phases se chevauchent séquentiellement. Il nécessite la coordination des processus cellulaires et moléculaires qui sont régulés temporellement et spatialement afin de restaurer la fonction barrière de l’épithélium endommagé. Dans la première phase, l’inflammation, les neutrophiles et les macrophages migrent dans la plaie, mobilisant les défenses locales et^{systémiques 1}. Suivre et chevaucher la phase inflammatoire est le stade de prolifération. Les fibroblastes commencent à proliférer rapidement et à migrer dans le tissu de granulation. Les kératinocytes éloignés du bord d’attaque prolifèrent vers la plaie à mesure que les kératinocytes différenciés du bord d’attaque migrent pour rééthélialiser^{la plaie 2}. Enfin, la phase de remodelage et de maturation commence, au cours de laquelle les fibroblastes dans le tissu de granulation commencent à synthétiser et à déposer le collagène. Le remodelage et l’organisation de la nouvelle matrice peuvent durer jusqu’à 1 an après la blessure³. En raison de la complexité des événements qui se chevauchent impliquant des discussions croisées entre plusieurs types de cellules, et malgré des années de recherche, bon nombre des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la cicatrisation des plaies demeurent mal compris.

Le modèle de souris est le modèle mammifère prédominant pour étudier les mécanismes de cicatrisation des plaies en raison de leur facilité d’utilisation, de leur coût relativement faible et de leur manipulabilité^{génétique 1,4,5}. Bien que différents types de blessures aient été décrits dans le modèle murin, le plus commun est une blessure excisionnelle (coup de poing bilatéral ou biopsie directe de poinçon), suivie des modèles incisionnels^{de blessure 4.} Le modèle excisionnel de blessure a un avantage distinct au-dessus du modèle incisionnel car il génère intrinsèquement le tissu de contrôle qui n’a pas subi le processus curatif. Le tissu de biopsie de poinçon qui est excisé dans le cadre du protocole chirurgical peut être traité de la même manière que le tissu blessé et employé pour établir les conditions homéostatiques pour un critère désiré. Le tissu de contrôle excisé peut également être utile si l’évaluation des effets d’un prétraitement de peau ou la confirmation de l’altération réussie de gène au moment de la^{blessure 4.}

Les paramètres de guérison peuvent être évalués par de nombreuses techniques différentes, y compris la planimétrie ou l’histologie. Cependant, la planimétrie ne peut évaluer que les caractéristiques visibles de la plaie, et en raison de la présence d’une croûte, souvent n’est pas corrélée aux mesures de guérison qui sont visualisées par l’histologie, faisant ainsi de l’histologie l’étalon-or de^{l’analyse 4}. Bien que l’analyse histologique soit l’étalon-or, elle est le plus souvent effectuée sur un sous-ensemble arbitraire de^{la plaie 6,7}. Par exemple, couper la plaie en « moitié » avant d’intégrer et de sectionner la plaie est actuellement une pratique courante pour réduire le temps et les ressources consacrés à la section des matériaux et à l’analyse des données. La méthode d’analyse morphométrique décrite dans ce protocole a été développée pour englober le tissu entier de blessure, pour refléter exactement les caractéristiques morphologiques de la blessure, et pour augmenter la probabilité de détecter des défauts curatifs de blessure avec une petite taille d’effet. Dans ce protocole, nous détaillons une méthode chirurgicale pour générer la blessure murine la plus couramment étudiée, la blessure excisionnelle bilatérale pleine épaisseur, aussi bien qu’une méthode détaillée et rigoureuse pour l’analyse histologique telle est rarement employée dans le domaine.

Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la réglementation fédérale et la politique et les procédures de l’Université de l’Iowa ont été approuvées par l’IACUC de l’Université de l’Iowa. 1. Animaux et élevage Utilisez des souris adultes de la lignée de souris désirée à l’âge de 8-10 semaines lorsque le stade du follicule pileux est en télogène. Le jour de la chirurgie, séparez les souris dans des cages propres et individuel…

Representative Results

La figure 5 représente la fourchette des valeurs mesurées et calculées obtenues en effectuant une analyse morphométrique sur des plaies de type sauvage générées par plusieurs chirurgiens et analysées par différents individus dans différentes souches de souris. Les souris de type sauvage de différentes souches peuvent afficher des différences statistiques telles que décrites dans nos études et dans lalittérature 9,10. S…

Discussion

Le modèle bilatéral de blessure excisional est une procédure hautement personnalisable qui peut être employée pour étudier beaucoup de différents aspects de la guérison de blessure. Avant de commencer un projet de cicatrisation des plaies, les chercheurs devraient effectuer une analyse de puissance pour déterminer le nombre de blessures nécessaires pour détecter un défaut d’une taille d’effet particulière. Des incohérences existent dans la littérature sur la question de savoir si des souris ou des bles…

Materials

100% ethanol
70% ethanol
80% ethanol
95% ethanol
Alcohol Prep	NOVAPLUS	V9100	70% Isopropyl alcohol, sterile
Ammonium hydroxide
Biopsy pads	Cellpath	22-222-012
Black plastic sheet			Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper
Brightfield microscope			With digital acquisition capabilities and a 4X objective
Cotton tipped applicators
Coverslips			22 x 60 #1
Dental wax sheets
Digital camera			Include a ruler for scale, if applicable
Dissection teasing needle (straight)
Embedding molds			22 x 22 x 12
Embedding rings	Simport Scientific Inc.	M460
Eosin Y
Glacial acetic acid
Hair clipper
Heating pad	Conair		Moist dry Heating Pad
Hematoxylin
Microtome
Microtome blades
Paint brushes
Paraffin Type 6
Paraformaldehyde
Permount
Phosphate buffer solution (PBS)
Povidone-iodine	Aplicare	82-255
Processing cassette	Simport Scientific Inc.	M490-2
Razor blades	ASR		.009 Regular Duty
Scalpel blades #10
Scalpel handle
Sharp surgical scissors			sterile for surgery
Skin biopsy punches			Size as determined by researcher
Slide boxes
Slide warmers
Superfrosted microscope slides	Fisher Scientific	22 037 246
Temperature control water bath
Tissue embedding station			Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate
Tissue processor			Minimum of a oven with a vacuum pump
Triple antibiotic opthalmic ointment
tweezers, curved tip			sterile for surgery
tweezers, tapered tip			sterile for surgery
WypAll X60	Kimberly-Clark	34865