Este protocolo descreve como gerar feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos e como monitorar, colher e preparar as feridas para análise morfométrica. Incluído é uma descrição aprofundada de como usar seções histológicas seriais para definir, quantificar e detectar defeitos morfométricos.
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Artigo de método
Modelo de cura da ferida excisional de Murine e Análise de Ferida Morfômica Histológica
Neste artigo
Resumo
Resumo
O modelo de ferida excisional de murina tem sido usado extensivamente para estudar cada uma das fases sequencialmente sobrepostas da cicatrização da ferida: inflamação, proliferação e remodelação. As feridas de Murina têm um leito de ferida histologicamente bem definido e facilmente reconhecível sobre o qual essas diferentes fases do processo de cura são mensuráveis. Dentro do campo, é comum o uso de um "meio" arbitrariamente definido da ferida para análises histológicas. No entanto, as feridas são uma entidade tridimensional e muitas vezes não histologicamente simétrica, apoiando a necessidade de um método bem definido e robusto de quantificação para detectar defeitos morfométricos com um pequeno tamanho de efeito. Neste protocolo, descrevemos o procedimento para a criação de feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos, bem como uma instrução detalhada sobre como medir parâmetros morfométricos usando um programa de processamento de imagem em seções seriais selecionadas. As medidas de duas dimensões do comprimento da ferida, comprimento epidérmico, área epidérmica e área da ferida são usadas em combinação com a distância conhecida entre as seções para extrapolar a área epidérmica de três dimensões que cobre a ferida, área geral da ferida, volume epidérmico e volume da ferida. Embora esta análise histológica detalhada seja mais demora e recursos do que as análises convencionais, seu rigor aumenta a probabilidade de detectar novos fenótipos em um processo de cicatrização de feridas inerentemente complexo.
Introdução
A cicatrização de feridas cutâneas é um processo biológico complexo com fases sequencialmente sobrepostas. Requer a coordenação de processos celulares e moleculares que são regulados temporal e espacialmente para restaurar a função de barreira do epitélio danificado. Na primeira fase, inflamações, neutrófilos e macrófagos migram para a ferida, mobilizando defesas locais e sistêmicas1. Seguir e sobrepor a fase inflamatória é o estágio de proliferação. Os fibroblastos começam a proliferar rapidamente e migrar para o tecido de granulação. Os queratinócitos para longe da borda principal proliferam direcionalmente em direção à ferida à medida que qu....
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Protocolo
Todos os experimentos foram concluídos de acordo e o cumprimento das regulamentações federais e as políticas e procedimentos da Universidade de Iowa foram aprovados pela Universidade de Iowa IACUC.
1. Animais e criação
- Use camundongos adultos da linha de camundongos desejada com 8-10 semanas de idade quando o estágio do folículo piloso estiver em telogen.
- No dia da cirurgia, separe os ratos em gaiolas limpas e abriga individualmente para minimizar a interrupção da ferida.
2. Cirurgia
NOTA: É desnecessário manter as condições cirúrgicas estéreis. Enquanto deve-se....
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Resultados
A Figura 5 retrata a faixa em valores medidos e calculados obtidos pela realização de análise morfométrica em feridas do tipo selvagem geradas em diferentes cepas de camundongos por vários cirurgiões e analisadas por diferentes indivíduos. Camundongos do tipo selvagem de diferentes cepas podem apresentar diferenças estatísticas como descrito tanto em nossos estudos quanto na literatura9,10. Com base nesses resultados representativos,.......
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Discussão
O modelo bilateral de ferida excisional é um procedimento altamente personalizável que pode ser usado para estudar muitos aspectos diferentes da cicatrização de feridas. Antes de iniciar um projeto de cicatrização de feridas, os investigadores devem realizar uma análise de energia para determinar o número de feridas necessárias para detectar um defeito de um determinado tamanho de efeito. Existem inconsistências na literatura sobre se camundongos individuais ou feridas devem ser usados como réplicas biológicas, no entant.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Somos gratos a todos os membros do Laboratório Dunnwald que contribuíram para a otimização deste protocolo ao longo dos anos, e a Gina Schatteman cuja persistência em promover o uso de seção serial para análise de feridas tornou sua criação possível. Este trabalho foi apoiado por financiamento do NIH/NIAMS para Martine Dunnwald (AR067739).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100% etanol | |||
| 70% etanol | |||
| 80% etanol | |||
| 95% etanol | |||
| Preparação de álcool | NOVAPLUS | V9100 | 70% Álcool isopropílico, |
| hidróxido de amônio | |||
| biópsia | Cellpath | 22-222-012 | |
| de plástico preta | Algo firme, mas manipulável, do tamanho de uma folha de papel | ||
| Microscópio | Com capacidades de aquisição digital e uma objetiva 4X | ||
| Aplicadores | |||
| Lamínulas | 22 x 60 #1 | ||
| Folhas | |||
| de cera dentalCâmera | Inclui uma régua para escala, se aplicável | ||
| Agulha de dissecção (reta) | |||
| de embutir | 22 x 22 x 12 | ||
| Anéis de embutir | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Ácido | |||
| Máquina de cortar | |||
| Almofada de aquecimento | Conair | Almofada de aquecimento seca úmida | |
| Micrótomo | |||
| hematoxilina | |||
| Lâminas de micrótomo | |||
| Pincéis | |||
| Parafina Tipo 6 | |||
| Paraformaldeído | |||
| Permount | |||
| Solução tampão de fosfato (PBS) | |||
| Povidona-iodo | Aplicare | 82-255 | |
| de processamento | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Lâminas de barbear | ASR.009 | Lâminas | |
| bisturi de serviço regular # 10 | |||
| bisturi | |||
| Tesoura | estéril para cirurgia | ||
| Punções | Tamanho conforme determinado pelo pesquisador | ||
| Caixas | |||
| Aquecedores de | |||
| Lâminas de microscópio superfrosted | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Banho-maria | |||
| Estação | de incorporação de tecidos Mínimo de um dispensador de parafina e uma placa fria | ||
| Processador | de tecidos Mínimo de um forno com bomba de vácuo | ||
| Antibiótico triplo pinças de pomada | |||
| , ponta | estéril para pinças | ||
| cirúrgicas, ponta | estéril para cirurgia | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
Referências
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular....
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Reimpressões e permissões
