कैल्शियम इमेजिंग में स्वतंत्र रूप से व्यवहार Caenorhabditis elegans अच्छी तरह से नियंत्रित, Nonlocalized कंपन के साथ
Summary
यहाँ रिपोर्ट कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक प्रणाली है स्वतंत्र रूप से अच्छी तरह से नियंत्रित, nonlocalized कंपन के साथ Caenorhabditis elegans व्यवहार में. यह प्रणाली शोधकर्ताओं को नैनो-स्केल विस्थापन पर अच्छी तरह से नियंत्रित गुणों के साथ गैर-स्थानीयकृत कंपन पैदा करने और कंपन के लिए सी एलिगन्स की प्रतिक्रियाओं के दौरान कैल्शियम धाराओं को मापने की अनुमति देती है।
Abstract
गैर-स्थानीयकृत यांत्रिक बल, जैसे कंपन और ध्वनिक तरंगें, विकास से होमोस्टैसिस तक विभिन्न प्रकार की जैविक प्रक्रियाओं को प्रभावित करती हैं। जानवर अपने व्यवहार को संशोधित करके इन उत्तेजनाओं का सामना करते हैं। इस तरह के व्यवहार संशोधन के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए ब्याज के व्यवहार के दौरान तंत्रिका गतिविधि के परिमाणीकरण की आवश्यकता होती है। यहां, हम विशिष्ट आवृत्ति, विस्थापन और अवधि के गैर-स्थानीयकृत कंपन के साथ स्वतंत्र रूप से Caenorhabditis elegans व्यवहार करने में कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। यह विधि एक ध्वनिक ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके अच्छी तरह से नियंत्रित, गैर-स्थानीयकृत कंपन के उत्पादन की अनुमति देती है और एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का परिमाणीकरण करती है। सिद्धांत के एक सबूत के रूप में, कंपन के लिए C. elegans के भागने की प्रतिक्रिया के दौरान एक एकल interneuron, AVA की कैल्शियम प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया जाता है। यह प्रणाली यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए व्यवहार प्रतिक्रियाओं को अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र की समझ की सुविधा प्रदान करेगी।
Introduction
जानवरों को अक्सर गैर-स्थानीयकृत यांत्रिक उत्तेजनाओं जैसे कंपन या ध्वनिक तरंगों 1,2 के संपर्क में लाया जाता है। क्योंकि ये उत्तेजनाएं होमियोस्टैसिस, विकास और प्रजनन को प्रभावित करती हैं, जानवरों को उनके साथसामना करने के लिए अपने व्यवहार को संशोधित करना चाहिए 3,4,5। हालांकि, इस तरह के व्यवहार संशोधन के अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट और तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है।
सूत्रकृमि में Mechanosensory व्यवहार, Caenorhabditis elegans, एक सरल व्यवहार प्रतिमान है, जिसमें कीड़े आमतौर पर आगे के आंदोलन से एक पिछड़े भागने की प्रतिक्रिया के लिए व्यवहार बदल जाते हैं जब वे nonlocalized कंपन6 मुठभेड़. इस व्यवहार को अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट मुख्य रूप से पांच संवेदी न्यूरॉन्स, इंटरन्यूरॉन्स के चार जोड़े और कई प्रकार के मोटर न्यूरॉन्स 7,8 से बना है। इसके अतिरिक्त, कीड़े बार-बार उत्तेजना 9,10,11 को शामिल करने वाले अंतराल प्रशिक्षणके बाद इस तरह के यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए अभ्यस्त होते हैं। इसलिए, यह सरल व्यवहार प्रतिक्रिया गैर-स्थानीयकृत कंपन-उत्तेजित व्यवहार और स्मृति दोनों के अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र की जांच करने के लिए एक आदर्श प्रणाली का गठन करती है। गैर-स्थानीयकृत कंपन के प्रभाव में स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले कीड़े में कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल सचित्र है। पहले रिपोर्ट किए गए सिस्टम की तुलना में, यह प्रणाली सरल है कि इसे ट्रैकिंग के लिए एक अतिरिक्त कैमरे की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, यह हमें आवृत्ति, विस्थापन, और nonlocalized कंपन की अवधि को बदलने के लिए अनुमति देता है। क्योंकि AVA interneurons की सक्रियता पिछड़े भागने की प्रतिक्रिया को प्रेरित करती है, कीड़े सह-व्यक्त GCaMP, एक कैल्शियम संकेतक, और TagRFP, एक कैल्शियम-असंवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एक AVA-विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण में एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। प्रोटोकॉल एवीए न्यूरॉन्स के सक्रियण को प्रदर्शित करता है क्योंकि एक वर्म आगे से पीछे की ओर आंदोलन में स्विच करता है। यह प्रोटोकॉल मेचानोसेंसरी व्यवहार के अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट तंत्र को समझने की सुविधा प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आम तौर पर, तंत्रिका गतिविधि के परिमाणीकरण के लिए पशु शरीर के आंदोलन पर एक जांच और / या प्रतिबंधों की शुरूआत की आवश्यकता होती है। हालांकि, मेचानोसेंसरी व्यवहार के अध्ययन के लिए, एक जांच और संयम का आक्रामक …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उपभेदों को प्रदान करने के लिए Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर को धन्यवाद देते हैं। इस प्रकाशन को वैज्ञानिक अनुसंधान (बी) के लिए JSPS KAKENHI अनुदान-इन-एड द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान सं। JP18H02483), अभिनव क्षेत्रों पर “सॉफ्ट रोबोट का विज्ञान” परियोजना (अनुदान सं। JP18H05474), चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी से प्रधानमंत्री (अनुदान संख्या 19gm6110022h001), और Shimadzu नींव।
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Autor | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
Referências
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