Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung
Summary
Hier wird ein System zur Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter , nicht lokalisierter Vibration berichtet. Dieses System ermöglicht es den Forschern, nicht lokalisierte Schwingungen mit gut kontrollierten Eigenschaften bei nanoskaliger Verschiebung hervorzurufen und Kalziumströme während der Reaktionen von C. elegans auf die Schwingungen zu quantifizieren.
Abstract
Nicht lokalisierte mechanische Kräfte wie Schwingungen und akustische Wellen beeinflussen eine Vielzahl biologischer Prozesse von der Entwicklung bis zur Homöostase. Tiere bewältigen diese Reize, indem sie ihr Verhalten ändern. Das Verständnis der Mechanismen, die einer solchen Verhaltensänderung zugrunde liegen, erfordert eine Quantifizierung der neuronalen Aktivität während des interessierenden Verhaltens. Hier berichten wir über eine Methode zur Kalziumbildgebung bei freiem Verhalten von Caenorhabditis elegans mit nicht lokalisierten Schwingungen spezifischer Frequenz, Verschiebung und Dauer. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingungen unter Verwendung eines akustischen Wandlers und die Quantifizierung evozierter Kalziumreaktionen bei Einzelzellauflösung. Als Beweis für das Prinzip wird die Calciumreaktion eines einzelnen Interneurons, AVA, während der Fluchtreaktion von C. elegans auf Vibration demonstriert. Dieses System wird das Verständnis neuronaler Mechanismen erleichtern, die Verhaltensreaktionen auf mechanische Reize zugrunde liegen.
Introduction
Tiere sind oft nicht lokalisierten mechanischen Reizen wie Vibrationen oder akustischen Wellenausgesetzt 1,2. Da diese Reize die Homöostase, Entwicklung und Fortpflanzung beeinflussen, müssen Tiere ihr Verhalten ändern, um mit ihnen fertig zu werden 3,4,5. Die neuronalen Schaltkreise und Mechanismen, die einer solchen Verhaltensänderung zugrunde liegen, sind jedoch kaum verstanden.
Mechanosensorisches Verhalten im Fadenwurz, Caenorhabditis elegans, ist ein einfaches Verhaltensparadigma, bei dem Würmer normalerweise ihr Verhalten von der Vorwärtsbewegung zu einer Rückwärtsfluchtreaktion ändern, wenn sie auf nichtlokalisierte Schwingungen stoßen6. Der neuronale Schaltkreis, der diesem Verhalten zugrunde liegt, besteht hauptsächlich aus fünf sensorischen Neuronen, vier Paaren von Interneuronen und mehreren Arten von Motoneuronen 7,8. Darüber hinaus gewöhnen sich Würmer an solche mechanischen Reize nach dem Training im Abstand mit wiederholter Stimulation 9,10,11. Daher stellt diese einfache Verhaltensreaktion ein ideales System dar, um neuronale Mechanismen zu untersuchen, die sowohl dem nicht lokalisierten Schwingungsverhalten als auch dem Gedächtnis zugrunde liegen. Ein Protokoll für die Kalziumbildgebung bei sich frei verhaltenden Würmern unter dem Einfluss von nicht lokalisierten Schwingungen wird veranschaulicht. Im Vergleich zu zuvor gemeldeten Systemen ist dieses System insofern einfach, als es keine zusätzliche Kamera für die Verfolgung benötigt. Es ermöglicht uns jedoch, die Frequenz, Verschiebung und Dauer der nicht lokalisierten Schwingung zu ändern. Da die Aktivierung der AVA-Interneuronen die Rückwärtsfluchtreaktion induziert, wurden Würmer, die GCaMP, einen Kalziumindikator, und TagRFP, ein calciuminsensitives fluoreszierendes Protein, unter der Kontrolle eines AVA-spezifischen Promotors mitexprimieren, als Beispiel verwendet (siehe Tabelle der Materialien für Details). Das Protokoll demonstriert die Aktivierung von AVA-Neuronen, wenn ein Wurm von der Vorwärts- zur Rückwärtsbewegung wechselt. Dieses Protokoll erleichtert das Verständnis des neuronalen Schaltkreismechanismus, der dem mechanosensorischen Verhalten zugrunde liegt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Allgemeinen erfordert die Quantifizierung der neuronalen Aktivität die Einführung einer Sonde und / oder Einschränkungen der Körperbewegung von Tieren. Für Studien des mechanosensorischen Verhaltens stellen jedoch die invasive Einführung einer Sonde und der Fesseln selbst mechanische Reize dar. C. elegans bietet ein System, um diese Probleme zu umgehen, weil seine Eigenschaften transparent sind und weil es einen einfachen, kompakten neuronalen Schaltkreis hat, der nur 302 Neuronen umfasst. Durch die Kom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Stämme. Diese Veröffentlichung wurde unterstützt durch JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant Nr. JP18H02483), zu innovativen Bereichen des Projekts “Science of Soft Robot” (Förderkennzeichen JP18H05474), die PRIME der Japan Agency for Medical Research and Development (Fördernummer 19gm6110022h001) und die Shimadzu-Stiftung.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Autor | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
Referências
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