JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Биоинформатический конвейер для исследования молекулярной эволюции и экспрессии генов с использованием RNA-seq

Published: May 28, 2021
doi:
10.3791/61633
,
1Department of Developmental and Cell Biology,University of California, Irvine

Summary

Целью этого протокола является исследование эволюции и экспрессии генов-кандидатов с использованием данных секвенирования РНК.

Abstract

Дистилляция и представление больших наборов данных, таких как данные всего генома или транскриптома, часто является сложной задачей. Один из способов разбить результаты — сосредоточиться на одном или нескольких семействах генов, которые важны для организма и исследования. В этом протоколе мы описываем биоинформативные шаги для создания филогении и количественной оценки экспрессии генов, представляющих интерес. Филогенетические деревья могут дать представление о том, как гены развиваются внутри и между видами, а также выявить орфографию. Эти результаты могут быть улучшены с использованием данных RNA-seq для сравнения экспрессии этих генов у разных людей или тканей. Исследования молекулярной эволюции и экспрессии могут выявить способы эволюции и сохранения функции генов между видами. Характеристика семейства генов может служить трамплином для будущих исследований и может выделить важное семейство генов в новом геноме или транскриптоме.

Introduction

Достижения в области технологий секвенирования облегчили секвенирование геномов и транскриптомов немоделированных организмов. В дополнение к повышенной возможности секвенирования ДНК и РНК от многих организмов, обилие данных является общедоступным для изучения генов, представляющих интерес. Целью этого протокола является предоставление биоинформатических шагов для исследования молекулярной эволюции и экспрессии генов, которые могут играть важную роль в интересуемом организме.

Исследование эволюции гена или семейства генов может дать представление об эволюции биологических систем. Члены семейства генов обычно определяются путем идентификации сохраненных мотивов или гомологичных последовательностей генов. Эволюция семейства генов ранее исследовалась с использованием геномов отдаленно связанных модельных организмов1. Ограничением этого подхода является то, что неясно, как эти семейства генов развиваются у близкородственных видов и роль различных селективных давлений окружающей среды. В этот протокол мы включаем поиск гомологов у близкородственных видов. Генерируя филогенез на уровне типа, мы можем отметить тенденции в эволюции семейства генов, такие как сохранение генов или дупликации, специфичные для линии. На этом уровне мы также можем исследовать, являются ли гены ортологами или паралогами. Хотя многие гомологи, вероятно, функционируют аналогично друг другу, это не обязательно так2. Включение филогенетических деревьев в эти исследования важно для решения вопроса о том, являются ли эти гомологичные гены ортологами или нет. У эукариот многие ортологи сохраняют аналогичные функции внутри клетки, о чем свидетельствует способность белков млекопитающих восстанавливать функцию дрожжевых ортологов3. Однако есть случаи, когда неортологичный ген выполняет характерную функцию4.

Филогенетические деревья начинают очертивать отношения между генами и видами, но функция не может быть назначена исключительно на основе генетических связей. Исследования экспрессии генов в сочетании с функциональными аннотациями и анализом обогащения обеспечивают сильную поддержку функции генов. Случаи, когда экспрессия генов может быть количественно оценена и сравнена между людьми или типами тканей, могут быть более показательными для потенциальной функции. Следующий протокол следует методам, используемым при исследовании генов опсина в Hydra vulgaris7,но они могут быть применены к любому виду и любому семейству генов. Результаты таких исследований обеспечивают основу для дальнейшего изучения функции генов и генных сетей в немоделовых организмах. В качестве примера, исследование филогении опсинов, которые являются белками, которые инициируют каскад фототрансдукции, дает контекст эволюции глаз и обнаружения света8,9,10,11. В этом случае немодельные организмы, особенно базальные виды животных, такие как книдарии или гребневицы, могут прояснить сохранение или изменения в каскаде фототрансдукции и зрения черезклады 12,13,14. Точно так же определение филогении, экспрессии и сетей других семейств генов проинформирует нас о молекулярных механизмах, лежащих в основе адаптаций.

Protocol

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными UC Irvine. 1. Подготовка библиотеки РНК-seq Изолируйте РНК с помощью следующих методов. Соберите образцы. Если РНК должна быть извлечена в более позднее время, флэш-заморозьте образец или поместите в раствор дл…

Representative Results

Приведенные выше методы обобщены на рисунке 1 и были применены к набору данных тканей Hydra vulgaris. H. vulgaris является пресноводным беспозвоночным, которое принадлежит к типу Cnidaria, который также включает кораллы, медузы и морские анемоны. H. vulgaris может размнож…

Discussion

Цель этого протокола состоит в том, чтобы дать краткое описание шагов для характеристики семейства генов с использованием данных RNA-seq. Было доказано, что эти методы работают для различных видов и наборов данных4,34,35. Созданный здесь кон?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Адриану Бриско, Гила Смита, Раби Мурада и Алин Г. Рангел за советы и рекомендации по включению некоторых из этих шагов в наш рабочий процесс. Мы также благодарны Кэтрин Уильямс, Элизабет Реббоа и Наташе Пиччиани за комментарии к рукописи. Эта работа была частично поддержана стипендией Фонда Джорджа Э. Хьюитта для медицинских исследований A.M.M.

Materials

Bioanalyzer-DNA kit Agilent 5067-4626 wet lab materials
Bioanalyzer-RNA kit Agilent 5067-1513 wet lab materials
BLAST+ v. 2.8.1 On computer cluster*
https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
Blast2GO (on your PC) On local computer
https://www.blast2go.com/b2g-register-basic
boost v. 1.57.0 On computer cluster
Bowtie v. 1.0.0 On computer cluster
https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/
Computing cluster (highly recommended) NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.
Cufflinks v. 2.2.1 On computer cluster
edgeR v. 3.26.8 (in R) In Rstudio
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
gcc v. 6.4.0 On computer cluster
Java v. 11.0.2 On computer cluster
MEGA7 (on your PC) On local computer
https://www.megasoftware.net
MEGAX v. 0.1 On local computer
https://www.megasoftware.net
NucleoSpin RNA II kit Macherey-Nagel 740955.5 wet lab materials
perl 5.30.3 On computer cluster
python On computer cluster
Qubit 2.0 Fluorometer ThermoFisher Q32866 wet lab materials
R v.4.0.0 On computer cluster
https://cran.r-project.org/src/base/R-4/
RNAlater ThermoFisher AM7021 wet lab materials
RNeasy kit Qiagen 74104 wet lab materials
RSEM v. 1.3.0 Computer software
https://deweylab.github.io/RSEM/
RStudio v. 1.2.1335 On local computer
https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download
Samtools v. 1.3 Computer software
SRA Toolkit v. 2.8.1 On computer cluster
https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
STAR v. 2.6.0c On computer cluster
https://github.com/alexdobin/STAR
StringTie v. 1.3.4d On computer cluster
https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/
Transdecoder v. 5.5.0 On computer cluster
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases
Trimmomatic v. 0.35 On computer cluster
http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Trinity v.2.8.5 On computer cluster
https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
TRIzol ThermoFisher 15596018 wet lab materials
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 Illumina RS-122-2001 wet lab materials
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907 wet lab materials
*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
  2. Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene orthology. Nature Reviews Genetics. 14 (5), 360-366 (2013).
  3. Dolinski, K., Botstein, D. Orthology and Functional Conservation in Eukaryotes. Annual Review of Genetics. 41 (1), (2007).
  4. Macias-Muñoz, A., McCulloch, K. J., Briscoe, A. D. Copy number variation and expression analysis reveals a non-orthologous pinta gene family member involved in butterfly vision. Genome Biology and Evolution. 9 (12), 3398-3412 (2017).
  5. Cannon, S. B., Mitra, A., Baumgarten, A., Young, N. D., May, G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana. BMC plant biology. 4, 10 (2004).
  6. Eastman, S. D., Chen, T. H. P., Falk, M. M., Mendelson, T. C., Iovine, M. K. Phylogenetic analysis of three complete gap junction gene families reveals lineage-specific duplications and highly supported gene classes. Genomics. 87 (2), 265-274 (2006).
  7. Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), 1-19 (2019).
  8. Hisatomi, O., Tokunaga, F. Molecular evolution of proteins involved in vertebrate phototransduction. Comparative Biochemistry and Physiology – B Biochemistry and Molecular Biology. 133 (4), 509-522 (2002).
  9. Arendt, D. Evolution of eyes and photoreceptor cell types. International Journal of Developmental Biology. 47, 563-571 (2003).
  10. Shichida, Y., Matsuyama, T. Evolution of opsins and phototransduction. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1531), 2881-2895 (2009).
  11. Porter, M. L., et al. Shedding new light on opsin evolution. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1726), 3-14 (2012).
  12. Plachetzki, D. C., Degnan, B. M., Oakley, T. H. The origins of novel protein interactions during animal opsin evolution. PLoS ONE. 2 (10), 1054 (2007).
  13. Ramirez, M. D., et al. The last common ancestor of most bilaterian animals possessed at least nine opsins. Genome Biology and Evolution. 8 (12), 3640-3652 (2016).
  14. Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biology. 10, 107 (2012).
  15. Pedersen, K. B., Williams, A., Watt, J., Ronis, M. J. Improved method for isolating high-quality RNA from mouse bone with RNAlater at room temperature. Bone Reports. 11, 100211 (2019).
  16. Ridgeway, J. A., Timm, A. E., Fallon, A. Comparison of RNA isolation methods from insect larvae. Journal of Insect Science. 14 (1), 4-8 (2014).
  17. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-Seq: Implications for differential expression and meta-Analyses. BMC Genomics. 21 (1), 1-9 (2020).
  18. Briscoe, A. D., et al. Female behaviour drives expression and evolution of gustatory receptors in butterflies. PLoS genetics. 9 (7), 1003620 (2013).
  19. Murad, R., Macias-Muñoz, A., Wong, A., Ma, X., Mortazavi, A. Integrative analysis of Hydra head regeneration reveals activation of distal enhancer-like elements. bioRxiv. , 544049 (2019).
  20. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. Impact of RNA degradation on measurements of gene expression. BMC Biology. 12, 42 (2014).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Trinity. . RNA-Seq De novo Assembly Using Trinity. , 1-7 (2014).
  23. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  24. Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC bioinformatics. 12, 323 (2011).
  25. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25 (2009).
  26. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10, 421 (2009).
  27. Conesa, A., Götz, S. Blast2GO: A comprehensive suite for functional analysis in plant genomics. International Journal of Plant Genomics. 619832, (2008).
  28. Conesa, A., et al. Blast2GO: A universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).
  29. Götz, S., et al. High-throughput functional annotation and data mining with the Blast2GO suite. Nucleic Acids Research. 36 (10), 3420-3435 (2008).
  30. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular biology and evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  31. Edgar, R. C. MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  32. Taddei-Ferretti, C., Musio, C., Santillo, S., Cotugno, A. The photobiology of Hydra’s periodic activity. Hydrobiologia. 530, 129-134 (2004).
  33. Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464 (7288), 592-596 (2010).
  34. Macias-Muñoz, A., Rangel Olguin, A. G., Briscoe, A. D. Evolution of phototransduction genes in Lepidoptera. Genome Biology and Evolution. 11 (8), 2107-2124 (2019).
  35. Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), (2019).
  36. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  37. Tavares, L., Alves, P. M., Ferreira, R. B., Santos, C. N. Comparison of different methods for DNA-free RNA isolation from SK-N-MC neuroblastoma. BMC research notes. 4, 3 (2011).
  38. Johnson, M. T. J., et al. Evaluating Methods for Isolating Total RNA and Predicting the Success of Sequencing Phylogenetically Diverse Plant Transcriptomes. PLoS ONE. 7 (11), (2012).
  39. Zhao, S., Zhang, Y., Gamini, R., Zhang, B., Von Schack, D. Evaluation of two main RNA-seq approaches for gene quantification in clinical RNA sequencing: PolyA+ selection versus rRNA depletion. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  40. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16 (1), 1-14 (2015).
  41. Corley, S. M., MacKenzie, K. L., Beverdam, A., Roddam, L. F., Wilkins, M. R. Differentially expressed genes from RNA-Seq and functional enrichment results are affected by the choice of single-end versus paired-end reads and stranded versus non-stranded protocols. BMC Genomics. 18 (1), 1-13 (2017).
  42. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8 (8), 1494-1512 (2013).
  43. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  44. Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification. Nature Biotechnology. 34 (5), 525-527 (2016).
  45. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  46. Araujo, F. A., Barh, D., Silva, A., Guimarães, L., Thiago, R. . OPEN GO FEAT a rapid web-based functional annotation tool for genomic and transcriptomic data. , 8-11 (2018).
  47. Huerta-Cepas, J., et al. Fast genome-wide functional annotation through orthology assignment by eggNOG-mapper. Molecular Biology and Evolution. 34 (8), 2115-2122 (2017).
  48. Huerta-Cepas, J., et al. EggNOG 5.0: A hierarchical, functionally and phylogenetically annotated orthology resource based on 5090 organisms and 2502 viruses. Nucleic Acids Research. 47, 309-314 (2019).
  49. Törönen, P., Medlar, A., Holm, L. PANNZER2: A rapid functional annotation web server. Nucleic Acids Research. 46, 84-88 (2018).
  50. Robinson, M., Mccarthy, D., Chen, Y., Smyth, G. K. . edgeR differential expression analysis of digital gene expression data User’s Guide. , (2013).
  51. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
  52. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: Paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
  53. Letunic, I., Bork, P. Interactive tree of life (iTOL) v3: an online tool for the display and annotation of phylogenetic and other trees. Nucleic acids research. 44, 242-245 (2016).

Tags

Bioinformatics PipelineMolecular EvolutionGene ExpressionRNA-seqSRA ToolkitNCBIFASTQReference GenomeGTFFASTAGene MappingGene ExpressionBLASTHomologous GenesGene AnnotationMEGA
check_url/pt/61633?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Macias-Muñoz, A., Mortazavi, A. A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq. J. Vis. Exp. (171), e61633, doi:10.3791/61633 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image