उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण का उपयोग कर CALR जीन में आनुवंशिक संस्करण का पता लगाने
Summary
हाई रेजोल्यूशन मेल्टिंग एनालिसिस (एचआरएम) जेनेटिक वैरिएंट डिटेक्शन के लिए एक संवेदनशील और रैपिड सॉल्यूशन है । यह अनुक्रम मतभेदों पर निर्भर करता है जिसके परिणामस्वरूप हेट्रोडुलेक्स पिघलने वाले वक्र के आकार को बदलते हैं। एचआरएम और एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस को जोड़कर, विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक वेरिएंट जैसे इनडेल्स की पहचान की जा सकती है।
Abstract
हाई रेजोल्यूशन मेल्टिंग एनालिसिस (एचआरएम) जेनोटीपिंग और जेनेटिक वेरिएशन स्कैनिंग के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। अधिकांश एचआरएम अनुप्रयोग डीएनए रंगों को संतृप्त करने पर निर्भर करते हैं जो अनुक्रम मतभेदों का पता लगाते हैं, और हेट्रोडुपेक्स जो पिघलने वाले वक्र के आकार को बदलते हैं। एक संस्करण या जीनोटाइप की पहचान करने वाले छोटे पिघलने वक्र मतभेदों की पहचान करने के लिए उत्कृष्ट साधन संकल्प और विशेष डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है। विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक वेरिएंट के साथ विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक वेरिएंट जीन में एक विशिष्ट रोग के रोगियों के लिए विशिष्ट रूप से देखे जा सकते हैं, विशेष रूप से कैंसर और कैल्र जीन में फिलाडेल्फिया गुणसूत्र-नकारात्मक myeloproliferative neoplasms के साथ रोगियों में । एचआरएम विश्लेषण द्वारा ब्याज के जीन में एकल न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन, सम्मिलन और/या विलोपन (इनडेल) का पता लगाया जा सकता है । विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक वेरिएंट की पहचान ज्यादातर क्यूपीसीआर एचआरएम परख में इस्तेमाल होने वाले नियंत्रणों पर आधारित होती है । हालांकि, जैसे-जैसे उत्पाद की लंबाई बढ़ती है, जंगली-प्रकार और हेट्रोज़िगोट घटता के बीच का अंतर छोटा हो जाता है, और आनुवंशिक संस्करण के प्रकार को निर्धारित करना अधिक कठिन होता है। इसलिए, जहां इनडेल्स ब्याज के जीन में अपेक्षित प्रचलित आनुवंशिक संस्करण हैं, एचआरएम परिणाम के स्पष्टीकरण के लिए एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस जैसे अतिरिक्त विधि का उपयोग किया जा सकता है। कुछ उदाहरणों में, मानक सेंगर अनुक्रमण द्वारा एक अनिर्णानीय परिणाम की पुन जांच/पुन निदान किया जाना चाहिए । इस पूर्वव्यापी अध्ययन में, हमने एमपीएन के साथ JAK2 V617F-नकारात्मक रोगियों के लिए विधि लागू की।
Introduction
कैल्मैटिकुलिन जीन(सीएएलआर)में दैहिक आनुवंशिक वेरिएंट को 2013 में माइलोप्रोप्रोलिफेरेटिव नियोप्लाज्म्स (एमपीएन) जैसे आवश्यक थ्रोम्बोसाइथेमिया और प्राथमिक मायलोफाइब्रोसिस1,2के रोगियों में मान्यता दी गई थी। तब से, CALR जीन में 50 से अधिक आनुवंशिक वेरिएंट की खोज की गई है, जो +1 (−1+2) फ्रेमशिफ्ट 3 को प्रेरित करतेहैं। दो सबसे अधिक बार CALR आनुवंशिक वेरिएंट एक ५२ बीपी विलोपन (NM_004343.३(CALR):c.1099_1150del52, पी (Leu367Thrfs * ४६)), भी टाइप 1 उत्परिवर्तन कहा जाता है, और एक 5 बीपी प्रविष्टि (NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC, पी (Lys385Asnfs * 47)), भी प्रकार 2 उत्परिवर्तन कहा जाता है । ये दोनों जेनेटिक वेरिएंट सभी सीएएलआर जेनेटिक वेरिएंट का 80% प्रतिनिधित्व करते हैं। अन्य लोगों को टाइप 1-लाइक या टाइप 2 के रूप में वर्गीकृत किया गया है- जैसे जंगली प्रकार CALR4के करीब एक α हेलिक्स के संरक्षण के आधार पर एल्गोरिदम का उपयोग करना। यहां, हम सीएएलआर जेनेटिक वैरिएंट डिटेक्शन, हाई रेजोल्यूशन मेल्टिंग एनालिसिस मेथड (एचआरएम) के लिए बेहद संवेदनशील और रैपिड तरीकों में से एक पेश करते हैं । यह विधि टाइप 1 और टाइप 2 जेनेटिक वेरिएंट का तेजी से पता लगाने में सक्षम बनाती है, जो सीएएलआर म्यूटेशन 5 केबहुमतका प्रतिनिधित्व करती है। एचआरएम को 1997 में फैक्टर वी लीडेन6में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक उपकरण के रूप में वास्तविक समय »पॉलीमरेज चेन रिएक्शन«(क्यूपीसीआर) के संयोजन में पेश किया गया था। गोल्डन स्टैंडर्ड तकनीक का प्रतिनिधित्व करने वाले सेंगर सीक्वेंसिंग की तुलना में, एचआरएम एक अधिक संवेदनशील और कम विशिष्ट विधि5है। एचआरएम विधि एक अच्छी स्क्रीनिंग विधि है जो बड़ी संख्या में नमूनों का तेजी से विश्लेषण करने में सक्षम बनाती है, जिसमें बड़ी लागत-लाभ5होता है। यह फ्लोरोसेंट डाई की उपस्थिति में किया जाने वाला एक सरल पीसीआर विधि है और विशिष्ट कौशल की आवश्यकता नहीं होती है। एक अन्य लाभ यह है कि प्रक्रिया स्वयं विश्लेषण किए गए नमूने को नुकसान या नष्ट नहीं करती है जो हमें एचआरएम प्रक्रिया7के बाद इलेक्ट्रोफोरेसिस या सेंगर अनुक्रमण के लिए नमूने का पुन: उपयोग करने की अनुमति देता है । एकमात्र नुकसान यह है कि कभी-कभी परिणामों की व्याख्या करना मुश्किल होता है। इसके अतिरिक्त, एचआरएम गैर-प्रकार 1 या टाइप 2 म्यूटेशन8के साथ रोगियों में सटीक उत्परिवर्तन का पता नहीं लगाता है। इन रोगियों में, सेंगर अनुक्रमण किया जाना चाहिए(चित्र 1)।
एचआरएम डीएनए फ्लोरोसेंट डाई को संतृप्त करने की उपस्थिति में विशिष्ट डीएनए क्षेत्र के प्रवर्धन पर आधारित है, जिसे डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) में शामिल किया गया है। फ्लोरोसेंट डाई डीएसडीएनए में शामिल होने पर प्रकाश उत्सर्जित करता है। तापमान में एक प्रगतिशील वृद्धि के बाद, DsDNA एकल फंसे डीएनए में टूट जाता है, जो फ्लोरेसेंस तीव्रता में अचानक कमी के रूप में पिघलने वक्र पर पता लगाया जा सकता है । पिघलने वाले वक्र का आकार डीएनए अनुक्रम पर निर्भर करता है जिसका उपयोग उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए किया जाता है। नमूनों के पिघलने घटता ज्ञात उत्परिवर्तन या जंगली प्रकार CALR के पिघलने घटता की तुलना में कर रहे हैं । अलग – अलग पिघलने वाले मोड़ एक अलग उत्परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं जो गैर टाइप 1 या टाइप 29है ।
एचआरएम द्वारा कैलआर जीन में दैहिक आनुवंशिक संस्करण का पता लगाने के लिए एल्गोरिदम, एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और अनुक्रमण विधि(चित्रा 1)का उपयोग10से पहले प्रकाशित पूर्वव्यापी अध्ययन में किया गया था और मान्य किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए का उच्च-संकल्प पिघलना जेनोटीपिंग और जेनेटिक वैरिएंट स्कैनिंग14के लिए एक सरल समाधान है । यह अनुक्रम मतभेदों पर निर्भर करता है जिसके परिणामस्वरूप हेट्रोडुलेक्स होते हैं जो पिघलने वाले व?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक विशेष हेमेटोलॉजी प्रयोगशाला, हेमेटोलॉजी विभाग, आंतरिक चिकित्सा विभाग, विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र जुब्लजाना में सभी अकादमिक विशेषज्ञों और कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
Referências
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) – More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
