Rilevamento di varianti genetiche nel gene CALR utilizzando l'analisi di fusione ad alta risoluzione
Summary
L’analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM) è una soluzione sensibile e rapida per il rilevamento di varianti genetiche. Dipende dalle differenze di sequenza che si traducono in eteroduplex che cambiano la forma della curva di fusione. Combinando l’elettroforesi hrM e gel di agarosio, è possibile identificare diversi tipi di varianti genetiche come gli indel.
Abstract
L’analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM) è un metodo potente per la genotipizzazione e la scansione delle variazioni genetiche. La maggior parte delle applicazioni HRM dipende da coloranti a DNA saturo che rilevano differenze di sequenza ed eteroduplex che cambiano la forma della curva di fusione. Sono necessari un’eccellente risoluzione dello strumento e uno speciale software di analisi dei dati per identificare le piccole differenze della curva di fusione che identificano una variante o un genotipo. Diversi tipi di varianti genetiche con frequenze diverse possono essere osservati nel gene specifico per i pazienti con una malattia specifica, in particolare il cancro e nel gene CALR nei pazienti con neoplasie mieloproliferative negative al cromosoma Philadelphia. Singoli cambiamenti nucleotidici, inserzioni e/o delezioni (indels) nel gene di interesse possono essere rilevati dall’analisi HRM. L’identificazione di diversi tipi di varianti genetiche si basa principalmente sui controlli utilizzati nel test qPCR HRM. Tuttavia, con l’aumentare della lunghezza del prodotto, la differenza tra curve wild-type ed eterozigoti diventa più piccola e il tipo di variante genetica è più difficile da determinare. Pertanto, laddove gli indels sono la variante genetica prevalente attesa nel gene di interesse, un metodo aggiuntivo come l’elettroforesi su gel di agarosio può essere utilizzato per la chiarificazione del risultato HRM. In alcuni casi, un risultato inconcludente deve essere ricontrollato/ri-diagnosticato mediante sequenziamento Sanger standard. In questo studio retrospettivo, abbiamo applicato il metodo a pazienti JAK2 V617F-negativi con MPN.
Introduction
Varianti genetiche somatiche nel gene della calreticulina (CALR) sono state riconosciute nel 2013 in pazienti con neoplasie mieloproliferative (MPN) come trombocitemia essenziale e mielofibrosi primaria1,2. Da allora, sono state scoperte più di 50 varianti genetiche nel gene CALR, inducendo un +1 (−1+2) frameshift3. Le due varianti genetiche CALR più frequenti sono una delezione di 52 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52,p.(Leu367Thrfs*46)), chiamata anche mutazione di tipo 1, e un’inserzione di 5 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC,p.(Lys385Asnfs*47)), chiamata anche mutazione di tipo 2. Queste due varianti genetiche rappresentano l’80% di tutte le varianti genetiche CALR. Gli altri sono stati classificati come tipo 1 o tipo 2 utilizzando algoritmi basati sulla conservazione di un’elica α vicino al tipo selvaggio CALR4. Qui, presentiamo uno dei metodi altamente sensibili e rapidi per il rilevamento delle varianti genetiche CALR, il metodo di analisi della fusione ad alta risoluzione (HRM). Questo metodo consente la rapida individuazione di varianti genetiche di tipo 1 e di tipo 2, che rappresentano la maggior parte delle mutazioni CALR 5. HRM è stato introdotto in combinazione con la “reazione a catena della polimerasi” in tempo reale (qPCR) nel 1997 come strumento per rilevare la mutazione nel fattore V Leiden6. Rispetto al sequenziamento Sanger che rappresenta la tecnica golden standard, HRM è un metodo più sensibile e meno specifico5. Il metodo HRM è un buon metodo di screening che consente un’analisi rapida di un gran numero di campioni con un grande rapporto costi-benefici5. Si tratta di un semplice metodo di PCR eseguito in presenza di un colorante fluorescente e non richiede competenze specifiche. Un altro vantaggio è che la procedura stessa non danneggia o distrugge il campione analizzato che ci consente di riutilizzare il campione per l’elettroforesi o il sequenziamento Sanger dopo la procedura HRM7. L’unico svantaggio è che a volte è difficile interpretare i risultati. Inoltre, HRM non rileva la mutazione esatta nei pazienti con mutazioni non di tipo 1 o di tipo2 8. In questi pazienti deve essere eseguito il sequenziamento Con Sanger (Figura 1).
L’HRM si basa sull’amplificazione della specifica regione del DNA in presenza di colorante fluorescente saturante di DNA, che è incorporato nel DNA a doppio filamento (dsDNA). Il colorante fluorescente emette luce quando incorporato nel dsDNA. Dopo un progressivo aumento della temperatura, il dsDNA si scompone in DNA a singolo filamento, che può essere rilevato sulla curva di fusione come un’improvvisa diminuzione dell’intensità di fluorescenza. La forma della curva di fusione dipende dalla sequenza di DNA utilizzata per rilevare la mutazione. Le curve di fusione dei campioni vengono confrontate con le curve di fusione di mutazioni note o CALR di tipo selvatico. Curve di fusione distinte rappresentano una mutazione diversa che non è di tipo 1 o di tipo 29.
L’algoritmo per la rilevazione di varianti genetiche somatiche nel gene CALR mediante HRM, elettroforesi su gel di agarosio e metodo di sequenziamento (Figura 1) è stato utilizzato e convalidato nello studio retrospettivo pubblicato prima del10.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fusione ad alta risoluzione del DNA è una soluzione semplice per la genotipizzazione e la scansione delle varianti genetiche14. Dipende dalle differenze di sequenza che si traducono in eteroduplex che cambiano la forma della curva di fusione. Diversi tipi di varianti genetiche con frequenze diverse possono essere osservati nel gene specifico per un certo gruppo di pazienti con cancro1,2,15,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare tutti gli esperti accademici e i dipendenti del Laboratorio di Ematologia Specializzata, Dipartimento di Ematologia, Divisione di Medicina Interna, Centro Medico Universitario di Lubiana.
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
Referências
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