JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Published: September 15, 2020
doi:
10.3791/61648
, ,
1Molecular Biology Program,Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Het volgen van individuele vertaalgebeurtenissen maakt kinetische studies met hoge resolutie van cap-afhankelijke vertaalmechanismen mogelijk. Hier demonstreren we een in vitro single-molecule assay op basis van beeldvormende interacties tussen fluorescerend gelabelde antilichamen en epitoop-gelabelde ontluikende peptiden. Deze methode maakt single-molecule karakterisering van initiatie en peptide rekkinetiek mogelijk tijdens actieve in vitro cap-afhankelijke vertaling.

Abstract

Cap-afhankelijke eiwitsynthese is de overheersende vertaalroute in eukaryotische cellen. Hoewel verschillende biochemische en genetische benaderingen uitgebreide studies van cap-afhankelijke vertaling en de regulering ervan mogelijk hebben maken, ontbreekt het nog steeds aan kinetische karakterisering van deze vertaalroute met hoge resolutie. Onlangs hebben we een in vitro test ontwikkeld om cap-afhankelijke vertaalkinetiek met single-molecule resolutie te meten. De test is gebaseerd op fluorescerend gelabeld antilichaambinding aan ontluikend epitoop-gelabeld polypeptide. Door de binding en dissociatie van antilichamen van en naar ontluikende peptide-ribosoom-mRNA-complexen in beeld te brengen, kan de vertaalprogressie op individuele mRNAs worden gevolgd. Hier presenteren we een protocol voor het vaststellen van deze test, inclusief mRNA- en PEGylated-diapreparaten, realtime beeldvorming van vertaling en analyse van trajecten met één molecuul. Deze test maakt het mogelijk om individuele cap-afhankelijke vertaalgebeurtenissen te volgen en lost belangrijke vertaalkinetiek op, zoals initiatie- en reksnelheden. De test kan op grote schaal worden toegepast op verschillende vertaalsystemen en zou in grote lijnen ten goede moeten komen aan in vitro studies van cap-afhankelijke vertaalkinetiek en translationele controlemechanismen.

Introduction

Vertaling in eukaryotische systemen vindt voornamelijk plaats via 7-methylguanosine (m7G) cap-afhankelijke trajecten1. Studies tonen aan dat de initiatiestap van eukaryotische vertaling tariefbeperkend is en een gemeenschappelijk doel voor voorschrift2,3,4. Mechanismen van cap-afhankelijke vertaling zijn uitgebreid bestudeerd met behulp van genetische5,biochemische6,7,8,structurele9en genomische10 bulkbenaderingen. Hoewel deze methoden verschillende mechanismen hebben geïdentificeerd die cap-afhankelijke initiatie reguleren, beperkt hun resolutie ze tot ensemble-middeling van signalen van heterogene en asynchrone initiatiegebeurtenissen. Meer recentelijk zijn individuele in vivo vertaalgebeurtenissen gevisualiseerd door methoden die fluorescerende antilichamen meten die zich binden aan epitopen op ontluikende polypeptiden11,12,13,14. Deze nieuwe benaderingen zijn echter ook beperkt in hun vermogen om individuele initiatiegebeurtenissen op te lossen, omdat meerdere fluorescerende antilichamen een ontluikend peptide moeten binden om enkelvoudige vertaalgebeurtenissen op te lossen vanuit een hoge intracellulaire fluorescentieachtergrond. In veel biologische interacties hebben opgeloste individuele kinetische gebeurtenissen kritische inzichten opgeleverd in het begrijpen van complexe multistep en repetitieve biologische processen die niet kunnen worden gesynchroniseerd op moleculair niveau. Nieuwe methoden die de dynamiek van individuele vertaalgebeurtenissen kunnen volgen, zijn nodig voor een beter begrip van cap-afhankelijke initiatie en regulering.

We hebben onlangs een in vitro test ontwikkeld die cap-afhankelijke initiatiekinetiek meet met single-molecule resolutie15. Gezien het grote aantal bekende en onbekende eiwitfactoren die betrokken zijn bij dit initiatietraject3,16, werd de test met één molecuul ontwikkeld om compatibel te zijn met bestaande in vitro celvrije vertaalsystemen om te profiteren van hun behoud van cellulaire factoren en robuuste vertaalactiviteit17,18,19,20,21,22,23,24,25. Bovendien maakt het gebruik van celvrije vertaalsystemen meer compatibele vergelijkingen mogelijk tussen waarnemingen met één molecuul en eerdere bulkresultaten. Deze aanpak biedt een eenvoudige integratie van nieuwe kinetische inzichten met één molecuul in het bestaande mechanistische kader van cap-afhankelijke initiatie. Om de test met één molecuul vast te stellen, wordt het traditionele celvrije vertaalsysteem op drie manieren gewijzigd: een epitoopcoderingssequentie wordt ingevoegd aan het begin van het open leeskader (ORF) van een reporter mRNA; het 3′-uiteinde van het reporter-mRNA wordt gebiotinyleerd om mRNA-eindtenthering aan het detectieoppervlak met één molecuul te vergemakkelijken; en fluorescerend gelabelde antilichamen worden aangevuld met het vertaalextract. Deze modificaties vereisen alleen basismoleculaire biologietechnieken en algemeen beschikbare reagentia. Bovendien behouden deze modificaties en de beeldvormingsomstandigheden met één molecuul de vertaalkinetiek van bulkcelvrije vertaalreacties15.

In deze test(figuur 1)wordt 5′-end capped en 3′-end biotinylated reporter mRNA geïmmobiliseerd naar een met streptavidine bedekt detectieoppervlak in een flowkamer. De stromingskamer wordt vervolgens gevuld met een celvrij vertaalmengsel aangevuld met fluorescerend gelabelde antilichamen. Nadat mRNA-vertaling heeft plaatsgevonden gedurende ongeveer 30-40 codons stroomafwaarts van de epitoopsequentie26,27, komt de epitoop uit de ribosoomuitgangstunnel en wordt toegankelijk voor interactie met fluorescerend gelabeld antilichaam. Deze interactie is snel en de detectie ervan door fluorescentiebeeldvormingstechnieken met één molecuul maakt het mogelijk om vertaalkinetiek met een enkele molecuulresolutie te volgen tijdens actieve celvrije vertaling. Deze test zou in grote lijnen ten goede moeten komen aan in vitro studies van cap-afhankelijke vertaalkinetiek en de regulering ervan, met name voor systemen met een werkende bulk in-vitrotest.

Een voorwaarde voor het vaststellen van deze test met één molecuul is een werkende bulkcelvrije vertaaltest, die kan worden bereikt met behulp van vertaalextract dat in de handel verkrijgbaar is of is bereid volgens eerder beschreven methoden28. Eukaryotisch vertaalextract kan worden verkregen uit verschillende cellen, waaronder schimmel, zoogdieren en planten28. Voor beeldvorming vereist deze test een TIRF-microscoop die is uitgerust met afstembare laserintensiteit en incidenthoek, een gemotoriseerd monsterstadium, een gemotoriseerd vloeistofsysteem en een monstertemperatuurregelingsapparaat. Dergelijke vereisten zijn generiek voor moderne in vitro TIRF-experimenten met één molecuul en kunnen anders worden bereikt. Het hier gepresenteerde experiment maakt gebruik van een objectief TIRF-systeem dat bestaat uit in de handel verkrijgde microscoop, software en accessoires die allemaal in de tabel met materialenworden vermeld.

Protocol

1. Generatie verslaggever mRNA Wijzig een DNA-transcriptiesjabloon die codeert voor een bulktest “untagged” reporter mRNA door een N-terminus epitoop tag-coderingssequentie in te voegen om een DNA-transcriptiesjabloon te genereren voor een “gelabelde” reporter mRNA (Figuur 2A).OPMERKING: 3xFLAG/anti-FLAG interactie wordt aanbevolen voor deze test vanwege de superieure gevoeligheid en de korte 3xFLAG tag lengte. De test is echter compatibel met andere epitoop-/antilichaamparen.<…

Representative Results

Volgens het beschreven protocol kunnen individuele antilichaaminteracties met ontluikende N-terminal-gelabelde polypeptiden met single-molecule resolutie worden gebeeldomd tijdens actieve celvrije vertaling van 3′ end-tethered reporter mRNA (Figuur 1). Een minimaal demonstratie-experiment wordt gerapporteerd met het gebruik van drie synthetische mRNAs: LUC (codering untagged luciferase), LUCFLAG (codering 3xFLAG-gelabeld luciferase) en hp-LU…

Discussion

In vergelijking met typische in vitro TIRF-experimenten met één molecuul is beeldvorming met één molecuul met de hier beschreven test bovendien complex vanwege het gebruik van celextract en een hoge concentratie fluorescerend gelabeld antilichaam. In vergelijking met de meer gebruikelijke praktijk van één ronde pegylatie van het oppervlak, vermindert een tweede ronde PEGylation (stap 2) de niet-specifieke antilichaambinding aan het detectieoppervlakaanzienlijk 15. De hoge concentrat…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R01GM121847]; de Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); en MSKCC Functional Genomics Initiative.

Materials

100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5′ cap, and 3′ poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5′ and 3′ ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Tags

Keywords: Single-molecule ImagingCap-dependent TranslationIn Vitro TranslationCell-free TranslationMicroscope SetupLaser ControlCamera SettingsSyringe PumpWash Protocol
check_url/pt/61648?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image