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Bioquímica

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

Published: September 15, 2020
doi:
10.3791/61648
, ,
1Molecular Biology Program,Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

個々の翻訳イベントを追跡することで、キャップ依存翻訳メカニズムの高解像度の運動研究が可能になります。ここでは、蛍光標識抗体とエピトープタグ付き新生ペプチドとのイメージング相互作用に基づく インビトロ 単分子アッセイを示す。この方法は、 インビトロ キャップ依存的なアクティブな翻訳中の開始およびペプチド伸長性キネティクスの単一分子特性を可能にする。

Abstract

キャップ依存性タンパク質合成は、真核細胞における主要な翻訳経路である。様々な生化学的および遺伝的アプローチにより、キャップ依存翻訳とその調節に関する広範な研究が可能になっているが、この翻訳経路の高解像度運動特性は依然として欠けている。最近では、キャップ依存性翻訳キネティクスを単一分子分解能で測定する インビトロ アッセイを開発しました。このアッセイは、蛍光標識された抗体が、新生エピトープタグ付きポリペプチドに結合することに基づいている。新生ペプチド-リボソーム-mRNA複合体との抗体の結合および解離をイメージングすることにより、個々のmRNA上の翻訳進行を追跡することができます。ここでは、mRNAおよびPEGylatedスライド調製物、翻訳のリアルタイムイメージング、単一分子軌道の解析など、このアッセイを確立するためのプロトコルを提示する。このアッセイは、個々のキャップ依存翻訳イベントの追跡を可能にし、開始率や伸長率などの主要な翻訳キネティクスを解決します。このアッセイは、明確な翻訳システムに広く適用することができ、キャップ依存翻訳キネティクスおよび翻訳制御機構の インビトロ 研究に広く役立つべきである。

Introduction

真核生物系における翻訳は、主に7-メチルグアノシン(m7G)キャップ依存経路1を介して起こる。研究は、真核生物翻訳の開始段階がレート制限であり、規則2、3、4の共通の目標であることを示している。キャップ依存性翻訳のメカニズムは、遺伝的5、生化学的6、7、8、構造9、およびゲノム10バルクアプローチを用いて広範囲に研究されてきた。これらの方法は、キャップ依存の開始を制御する多様なメカニズムを特定しましたが、その解決は、異種および非同期開始イベントからの信号のアンサンブル平均に制限されます。さらに最近では、生体内翻訳イベントの個々の可視化は、新生ポリペプチド11、12、13、14上のエピトープに結合する蛍光抗体を測定する方法によって可視化されている。しかし、これらの新しいアプローチは、複数の蛍光抗体が新生ペプチドに結合して、単一の翻訳事象を高細胞内蛍光のバックグラウンドから解決できるようにするために、個々の開始事象を解決する能力にも限界があります。多くの生物学的相互作用において、解決された個々の運動事象は、分子レベルで同期することができない複雑な多段階および反復的な生物学的プロセスを理解するための重要な洞察を提供してきた。キャップ依存の開始と規制をより深く理解するためには、個々の翻訳イベントのダイナミクスを追跡できる新しい方法が必要です。

我々は最近、単一分子分解能15を有するキャップ依存性開始運動を測定するインビトロアッセイを開発した。この開始経路3,16に関与する既知および未知のタンパク因子の多数を考慮すると、単一分子アッセイは、細胞因子および堅牢な翻訳活性17、18、19、20、21、22、23、24、25の保存の恩恵を受けるために、既存のインビトロ無細胞翻訳系と互換性があるように開発された。さらに、無細胞翻訳システムを使用することで、単一分子観測と以前のバルク結果との比較がより互換性があります。このアプローチは、キャップ依存開始の既存の機械化フレームワークに新しい単一分子運動学的洞察を簡単に統合することを提供する。単一分子アッセイを確立するために、従来の無細胞翻訳システムは3つの方法で修飾されます:エピトープコード配列はレポーターmRNAのオープンリーディングフレーム(ORF)の最初に挿入されます。レポーターmRNAの3′末端は、単一分子検出表面へのmRNA末端テザリングを容易にするためにビオチン化される。蛍光標識抗体は翻訳抽出物に補足されます。これらの修飾は、基本的な分子生物学の技術と一般的に入手可能な試薬のみを必要とします。さらに、これらの改変および単一分子イメージング条件は、バルク無細胞翻訳反応15の翻訳動態を維持する。

このアッセイ(図1)において、5′末端キャップおよび3′末端ビオチン化レポーターmRNAは、流れチャンバ内のストレプトアビジン被覆検出面に固定化される。流れチャンバは、次いで蛍光標識抗体を補充した無細胞翻訳混合物で満たされる。エピトープ配列26,27の下流にある約30~40コドンに対するmRNA翻訳が行われた後、エピトープはリボソーム出口トンネルから出現し、蛍光標識抗体と相互作用するようになります。この相互作用は迅速であり、単一分子蛍光イメージング技術による検出により、活性無細胞翻訳中の単一分子分解能による翻訳キネティックスの追跡が可能になります。このアッセイは、キャップ依存翻訳キネティクスとその規制、特に働くバルクインビトロアッセイを有するシステムに関するインビトロ研究に大きく利益をもたらすべきである。

この単一分子アッセイを確立するための前提条件は、働くバルク無細胞翻訳アッセイであり、市販または前に述べた方法28に記載された翻訳抽出物を使用して達成することができる。真核生物翻訳抽出物は、真菌、哺乳類、および植物28を含む多様な細胞から得ることができる。イメージングのために、このアッセイは、調整可能なレーザー強度と入射角度、電動サンプルステージ、電動流体システム、およびサンプル温度制御装置を備えたTIRF顕微鏡を必要とします。このような要件は、現代 のインビトロ 単一分子TIRF実験に対して一般的であり、異なる方法で達成され得る。ここで紹介する実験では、市販の顕微鏡、ソフトウェア、および付属品から構成される客観的なタイプのTIRFシステムを使用して、すべての 材料表に記載されています。

Protocol

1. レポーターmRNAの生成 N末端エピトープタグエンコーディング配列を挿入して「タグ付けされた」レポーターmRNAのDNA転写テンプレートを生成することによって、一括アッセイ「タグなし」レポーターmRNAをコードするDNA転写テンプレートを修正する(図2A)。注:3xFLAG/アンチフラッグの相互作用は、その優れた感度と短い3xFLAGタグ長のために、このアッセイのため…

Representative Results

記載されたプロトコルに従って、3’末端テザリングレポーターmRNAの活性無細胞翻訳中に単一分子分解能を有する新生N末端タグ付きポリペプチドとの個々の抗体相互作用のイメージングを可能にする(図1)。最小の実証実験は、3つの合成mRNAを使用して報告されます: LUC (タグなしルシファーゼをコード化), LUCFLAG (3xFLAGタグ付きルシファーゼをコ?…

Discussion

一般的なインビトロTIRF単一分子実験と比較して、ここで説明するアッセイによる単一分子イメージングは、細胞抽出物および蛍光標識抗体の高濃度の使用による追加的に複雑である。1ラウンドの表面PEGylationの一般的な手法と比較して、PEGylationの第2ラウンド(ステップ2)は、検出面15に結合する非特異的抗体を大幅に減少させる。蛍光性抗体の拡散濃度が高いと、極め…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立衛生研究所[R01GM121847]によってサポートされました。メモリアルスローンケタリングがんセンター(MSKCC)サポートグラント/コアグラント(P30 CA008748);そしてMSKCC機能ゲノミクスイニシアティブ

Materials

100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004
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Keywords: Single-molecule ImagingCap-dependent TranslationIn Vitro TranslationCell-free TranslationMicroscope SetupLaser ControlCamera SettingsSyringe PumpWash Protocol
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Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).
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