캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석
Summary
개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.
Abstract
캡 의존성 단백질 합성은 진핵 세포에서 주요 번역 경로입니다. 다양한 생화학 적 및 유전 적 접근은 캡 의존 성 번역 및 규제의 광범위한 연구를 허용했지만,이 번역 경로의 고해상도 운동 특성화는 여전히 부족합니다. 최근에는 단일 분자 분해능으로 캡 의존형 번역 운동학을 측정하기 위한 체외 분석서를 개발했습니다. 상기 분석법은 초기 에피토프 태그폴리펩티드에 형광표지 항체 결합을 기반으로 한다. 초기 펩타이드-리보솜-mRNA 복합체를 통해 항체의 결합 및 해리를 이미징함으로써 개별 mRNA에 대한 번역 진행을 추적할 수 있다. 여기서는 mRNA 및 PEGylated 슬라이드 제제, 번역의 실시간 이미징 및 단일 분자 궤적 분석을 포함한 이 분석 방법을 확립하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 개별 캡 종속 번역 이벤트를 추적할 수 있게 해주며 개시 및 신장 속도와 같은 주요 번역 역학을 해결합니다. 분석은 뚜렷한 번역 시스템에 널리 적용될 수 있으며 캡 의존성 번역 역학 및 번역 제어 메커니즘의 체외 연구에서 광범위하게 이점을 얻을 수 있습니다.
Introduction
진핵 계통에서의 번역은 주로 7-메틸구아노신(m7G) 캡 의존경로1을통해 발생한다. 연구에 따르면 진핵 번역의 개시 단계는 속도 제한및 규정2,3,4에대한 공통의 목표임을 나타낸다. 캡 의존형 번역의 메커니즘은유전5,생화학6,7,8,구조9,및 게놈10 벌크 접근법을 사용하여 광범위하게 연구되었다. 이러한 방법은 캡 의존개시를 조절하는 다양한 메커니즘을 확인했지만, 해상도는 이기종 및 비동기 개시 이벤트에서 신호의 평균을 앙상블로 제한합니다. 최근에는 생체내 번역 이벤트가 초기 폴리펩티드(11,12,13,14)에대한에피토프에 대한 형광 항체 결합을 측정하는 방법에 의해 시각화되었다. 그러나, 이러한 새로운 접근법은 또한 다중 형광 항체가 높은 세포내 형광 배경에서 단일 번역 이벤트를 해결할 수 있도록 초기 펩티드를 결합해야 하기 때문에 개별 개시 사건을 해결하는 능력에 제한됩니다. 많은 생물학적 상호 작용에서, 해결된 개별 운동 사건은 분자 수준에서 동기화할 수 없는 복잡한 다단계 및 반복적인 생물학 프로세스를 이해하는 중요한 통찰력을 제공했습니다. 캡 의존개시 및 규제를 더 잘 이해하기 위해서는 개별 번역 이벤트의 역학을 추적할 수 있는 새로운 방법이 필요합니다.
우리는 최근에 단 하나 분자 분해능15를가진 캡 의존성 개시 운동학을 측정하는 체외 분석서를 개발했습니다. 이 개시 경로3,16에관여하는 많은 공지되고 알려지지 않은 단백질 인자를 고려하여, 단일 분자 분석체는 세포인자 및 견고한 번역활동(17,18,19,20,21,22,23,24, 25,25)의보존으로부터 이익을 얻는 기존의 체외 세포 없는 번역 시스템과 호환될 수 있도록 개발되었다. 또한, 세포 없는 번역 시스템의 사용은 단일 분자 관측및 이전 대량 결과 사이 더 호환 비교를 허용합니다. 이 접근법은 캡 의존개시의 기존 기계론적 프레임워크에 새로운 단일 분자 운동 통찰력의 직진 통합을 제공합니다. 단일 분자 분석방식을 확립하기 위해, 기존의 세포없는 번역 시스템은 세 가지 방법으로 변형된다: 에피토프 인코딩 서열은 리포터 mRNA의 개방 독서 프레임 (ORF)의 시작 부분에 삽입된다; 기자 mRNA의 3′ 끝은 단일 분자 검출 표면에 mRNA 최종 테더링을 용이하게하기 위해 바이오티닐화된다; 형광으로 표지된 항체는 번역 추출물로 보충된다. 이러한 수정은 기본적인 분자 생물학 기술과 일반적으로 사용할 수있는 시약만 필요합니다. 더욱이, 이러한 변형 및 단일 분자 이미징 조건은 대량 세포 없는 번역 반응의 번역 역학을보존한다(15).
이 분석체(그림1)에서5′-end 캡 및 3′-end 바이오타이니드 리포터 mRNA는 유동 챔버에서 스트렙타비딘 코팅 검출 표면에 고정된다. 유동 챔버는 형광으로 표지된 항체로 보충된 세포없는 번역 혼합물로 채워져 있습니다. mRNA 번역후 약 30-40코돈 하류의 에피토프서열(26,27)을위해 발생한 후, 에피토프는 리보솜 출구 터널에서 나오고 형광으로 표지된 항체와 상호 작용할 수 있게 된다. 이러한 상호 작용은 급속하고 단일 분자 형광 이미징 기술에 의한 검출을 통해 활성 세포 없는 번역 중에 단일 분자 분해능으로 번역 역학을 추적할 수 있습니다. 이 분석은 캡 의존성 번역 역학 및 규제, 특히 체외 분석에서 대량 으로 작동하는 시스템의 경우 체외 연구에서 광범위하게 이점을 얻을 수 있습니다.
이러한 단일 분자 분석법을 확립하기 위한 전제 조건은 이전에 설명된방법(28)에따라 상업적으로 사용 가능하거나 제조된 번역 추출물을 사용하여 달성될 수 있는 대량 세포 없는 번역 분석이다. 진핵 번역 추출물은 곰팡이, 포유류 및식물(28)을포함한 다양한 세포로부터 얻을 수 있다. 이미징의 경우, 이 분석법은 튜닝 가능한 레이저 강도 및 사고 각도, 전동 식 샘플 단계, 동력 유체 시스템 및 샘플 온도 제어 장치가 장착된 TIRF 현미경이 필요합니다. 이러한 요구 사항은 현대 체외 단일 분자 TIRF 실험에 대한 일반적이며 다르게 달성 될 수있다. 여기에 제시된 실험은 재료표에나열된 시판되는 현미경, 소프트웨어 및 액세서리로 구성된 객관적인 유형의 TIRF 시스템을 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전형적인 시험관내 TIRF 단일 분자 실험과 비교하여, 여기에 기재된 분석기를 사용한 단일 분자 이미징은 세포 추출물의 사용과 형광으로 표기된 항체의 고농도로 인해 더욱 복잡하다. 표면 PEGylation의 한 라운드의 일반적인 관행에 비해, PEGylation (단계 2)의 두 번째 라운드는 검출 표면(15)에비특이적 항체 결합을 크게 감소시킨다. 확산형광 항체의 고농도는 항체 결합의 단?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 국가 학회 [R01GM121847]에 의해 지원되었다; 기념 슬론 케터링 암 센터 (MSKCC) 지원 보조금 / 핵심 보조금 (P30 CA008748); MSKCC 기능 유전체학 이니셔티브.
Materials
| 100X oil objective, N.A. 1.49 | Olympus | UAPON 100XOTIRF | |
| Acryamide/bis (40%, 19:1) | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Alkaline liquid detergent | Decon | 5332 | |
| Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) | UCT Specialties, LLC | A0700 | |
| Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD | Andor | DU-897U-CSO-#BV | |
| Andor Solis software | Andor | For controlling the Andor EMCCD | |
| Band-pass filter | Chroma | 532/640/25 | |
| Band-pass filter | Chroma | NF03-405/488/532/635E-25 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio Inc | Biotin-PEG-SVA | |
| Coenzyme A free acid | Prolume | 309-250 | |
| Coolterm software | For controlling the syringe pump | ||
| Desktop computer | Dell | For controlling the microscope, camera, stage, and pump. | |
| Dichroic mirror | Semrock | R405/488/532/635 | |
| Direct-zol RNA microprep 50RNX | Fisher Scientific | NC1139450 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Epoxy | Devcon | 14250 | |
| Firefly luciferin D-Luciferin free acid | Prolume | 306-250 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP1185500 | |
| Hydrogen perioxide | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | |
| Immersion oil | Olympus | Z-81226A | Low auto-fluorescence |
| Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
| MEGASCRIPT T7 Transcription Kit | Thermo fisher | AM1334 | |
| Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific | 3048 | |
| Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 | Sigma-Aldrich | A9594 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio Inc | mPEG-SVA-5000 | |
| MS(PEG)4 | Thermo Scientific | 22341 | |
| NaCl (5M) | Thermo Scientific | AM9760G | |
| No 1.5 microscope Cover glass | Fisherband | 12-544-C | |
| Olympus Laser, 532nm 100mM | Olympus digital Laser system | CMR-LAS 532nm 100mW | |
| Olympus TirfCtrl software | Olympus | For controlling the laser intensity and incident angle | |
| Optical table | TMC vibration control | 63-563 | With vibration isolation |
| Phenol chloroform isoamyl alcohol mix | Sigma-Aldrich | 77617-100ml | |
| Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit | Thermo Scientific | 20160 | |
| Potassium hydroxide pellets | Sigma-Aldrich | P1767-500G | |
| Prior motorized XY translation stage | Prior | PS3J100 | |
| Prior PriorTest software | Prior | For controlling the Prior motorized stage | |
| Recombinant RNasin RNase Inhibitor | Promega | N2515 | |
| Stage top Incubator | In vivo scientific (world precision Instruments) | 98710-1 | With a custom built acrylic cage |
| Staining jar | Fisher Scientific | 08-817 | |
| Streptavidin | Thermo Scientific | 43-4301 | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300212 | |
| SYBR green II | Fisher Scientific | S7564 | |
| Syringe | Hamilton | 1725RN | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | 55-3333 | |
| Tris (1M), pH = 7.0 | Thermo Scientific | AM9850G | |
| Ultrasonic Bath | Branson | CPX1800H | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Vaccinia Capping system | New England Biolabs | M2080S | |
| Zymo-Spin IC Columns | Zymo Research | C1004 |
Referências
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