Protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è dimostrare come preparare campioni di cristallografia seriale per la raccolta dei dati su un iniettore ad alto viscoso, Lipidico, recentemente commissionato al sincrotrone australiano.
Abstract
Presso il sincrotrone australiano è stata sviluppata una struttura per l’esecuzione di misurazioni seriali della cristallografia. Questa struttura incorpora un iniettore ad alta viscosità appositamente costruito, Lipidico, come parte della linea di fascio di cristallografia macromolecolare (MX2) per misurare un gran numero di piccoli cristalli a temperatura ambiente. L’obiettivo di questa tecnica è quello di consentire la produzione/trasferimento di cristalli su siringhe di vetro da utilizzare direttamente nell’iniettore per la raccolta dei dati della cristallografia seriale. I vantaggi di questo iniettore includono la capacità di rispondere rapidamente alle variazioni della portata senza interruzione del flusso. Esistono diverse limitazioni per questo iniettore ad alta viscosità (HVI) che includono una restrizione sulle viscosità del campione consentite a >10 Pa.s. La stabilità del flusso può anche essere potenzialmente un problema a seconda delle proprietà specifiche del campione. Qui viene presentato un protocollo dettagliato su come impostare i campioni e utilizzare l’iniettore per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano. Il metodo dimostra la preparazione del campione, incluso il trasferimento di cristalli di glisozima in un supporto ad alta viscosità (grasso siliconico) e il funzionamento dell’iniettore per la raccolta dei dati a MX2.
Introduction
La cristallografia seriale (SX) è una tecnica sviluppata inizialmente nel contesto dei laser a elettroni liberi a raggi X (XFEL)1,2,3,4. Sebbene gli approcci target fissi possano essere utilizzati per SX5,6,7, in genere, i sistemi di iniettori vengono utilizzati per fornire cristalli in un flusso continuo al fascio di raggi X. Poiché combina i dati di un gran numero di cristalli, SX evita la necessità di qualsiasi allineamento cristallino durante l’esperimento e consente di raccogliere dati a temperaturaambiente 8,9. Con l’aiuto di un iniettore adatto, i cristalli vengono trasmessi uno per uno nell’area di interazione a raggi X e i dati di diffrazione risultanti vengono raccolti su un rilevatore di area9,10. Ad oggi, SX è riuscita a risolvere un certo numero di strutture proteiche1,11,12,13 compresii cristalli troppo piccoli per misurare usando la cristallografia convenzionale. Ha anche fornito nuove informazioni sulla dinamica molecolare risolta nel tempo sfruttando la durata dell’impulso del femtosecondo dell’XFEL. Avviando reazioni pompa-sonda con sorgenti laser ottiche, sono stati effettuati studi approfonditi sul fotosistema II14,15, proteina gialla fotoattiva16,17, citocromo C ossidasi18, nonché batteriorhodopsina19,20,21. Questi studi hanno sondato la dinamica di trasferimento degli elettroni che si verifica dopo l’attivazione della luce dimostrando il significativo potenziale della cristallografia seriale per comprendere i processi biologici risolti nel tempo.
Lo sviluppo della cristallografia seriale sta diventando sempre più diffuso anche nelle sorgenti di sincrotrone9,12,20,22,23,24. L’SX a base di sincrotrone consente di misurare in modo efficiente un gran numero di singoli cristalli a temperatura ambiente utilizzando un sistema di iniettore appropriato. Questo approccio è adatto per cristalli più piccoli, quindi, oltre a richiedere un rilevatore di frame-rate veloce per raccogliere i dati, è richiesto anche un fascio micro-focalizzato. Rispetto alla cristallografia convenzionale, SX non comporta il montaggio e l’allineamento di singoli cristalli nel fascio di raggi X. Poiché i dati provenienti da un gran numero di singoli cristalli vengono fusi, la dose di radiazioni ricevuta da ciascun cristallo può essere sostanzialmente ridotta rispetto alla cristallografia convenzionale. Synchrotron SX può anche essere applicato allo studio di reazioni risolte nel tempo, anche fino al regime millisecondo, a condizione che sia disponibile un rilevatore con una frequenza fotogrammi sufficientemente elevata (ad esempio, 100 Hz o più). Diversi esperimenti di cristallografia seriale sono stati effettuati presso il sincrotrone utilizzando iniettori che sono stati inizialmente sviluppati a sorgenti XFEL20,22,23. I due tipi più comuni di iniettore sono l’ugello virtuale dinamico a gas (GDVN)25 e l’iniettore ad alta viscosità (HVI)9,24,26,27,28. Il GDVN è ideale per iniettare bassa viscosità, campioni liquidi, ma richiede elevate portate per ottenere flussi stabili, il che a sua volta porta ad alti tassi di consumo del campione. Al contrario, gli HVI sono adatti per campioni ad alta viscosità che consentono la generazione di un flusso stabile a portate molto più basse, portando a un consumo di campioni molto più basso. L’iniettore HVI, quindi, favorisce la consegna di campioni in cui è preferibile un vettore viscoso (ad esempio, a base lipidica per proteine di membrana) e / o grandi quantità di campione non sono disponibili. Gli iniettori SX sono generalmente difficili da usare e richiedono un’ampia formazione per funzionare. Essi comportano anche lunghi protocolli di trasferimento del campione, in quanto il campione deve essere caricato in un serbatoio specializzato, il che presenta generalmente un alto rischio associato alla perdita del campione nel “volume morto” o tramite perdite nelle connessioni. Pertanto, è auspicabile ottimizzare il design dell’iniettore per mitigare eventuali perdite prima che il campione raggiunga il fascio di raggi X.
Recentemente, i primi risultati SX sono stati pubblicati utilizzando Lipidico23 con un bersaglio di lisozima, utilizzando un rilevatore Eiger 16M. Questa progettazione dell’iniettore limita lo spreco di campioni riducendo al minimo il numero di passaggi necessari per andare dalla cristallizzazione iniziale al trasferimento dei cristalli nell’iniettore seguito dalla consegna del campione al fascio di raggi X. Questo manoscritto descrive e illustra la procedura di trasferimento del campione a partire dalla preparazione del campione, passando al processo di iniezione e infine alla raccolta dei dati, utilizzando lo stesso contenitore di cristallizzazione. Viene descritto anche il funzionamento dell’iniettore.
Protocol
Representative Results
Discussion
È stato sviluppato un HVI alternativo, ideale per effettuare esperimenti SX a sorgenti di sincrotrone. Ha due vantaggi chiave rispetto agli HVI esistenti. Innanzitutto, è facile da installare sulla linea di fascio consentendo un rapido passaggio tra la cristallografia convenzionale e SX, sono necessari solo ~ 30 minuti per l’installazione e l’allineamento su MX2. In secondo luogo, le siringhe campione utilizzate per coltivare cristalli possono essere utilizzate direttamente come serbatoi per iniezione, limitando gli sp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dall’Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Questa ricerca è stata intrapresa in parte utilizzando la linea di fascio MX2 presso l’Australian Synchrotron, parte dell’ANSTO, e ha fatto uso del rivelatore Australian Cancer Research Foundation (ACRF).
Materials
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
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