Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.
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Artigo de método
Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O isolamento dos espermatocitotas meioticos é essencial para investigar mecanismos moleculares subjacentes à meiose e espermatogênese. Embora existam protocolos de isolamento celular estabelecidos usando manchas hoechst 33342 em combinação com a classificação celular ativada pela fluorescência, ela requer classificadores celulares equipados com um laser ultravioleta. Aqui descrevemos um protocolo de isolamento celular usando a mancha DyeCycle Violet (DCV), um corante de ligação de DNA de baixa citotoxicidade estruturalmente semelhante ao Hoechst 33342. O DCV pode ser animado por lasers ultravioleta e violeta, o que melhora a flexibilidade da escolha do equipamento, incluindo um classificador de células não equipado com um laser ultravioleta. Usando este protocolo, pode-se isolar três subpopulações de células vivas em prophase I meiotic, incluindo leptoteno/zygotene, paquitene e espermatocitotes diploteno, bem como espermatoides redondos pós-meioticos. Também descrevemos um protocolo para preparar suspensão de célula única de testículos de mouse. No geral, o procedimento requer um curto período de tempo para ser concluído (4-5 horas, dependendo do número de células necessárias), o que facilita muitas aplicações a jusante.
Introdução
A espermatogênese é um processo complexo em que uma pequena população de células-tronco espermatogonial sustenta a produção contínua de um grande número de espermatozoides ao longo da vida adulta1,2. Durante a espermatogênese, a remodelação dinâmica da cromatina ocorre quando as células espermatogênicas sofrem meiose para produzir espermatóides haploides3,4,5. O isolamento dos espermatocitos meioticos é essencial para a investigação molecular, e várias abordagens diferentes para isolados espermatotocitos meioticos for....
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Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (protocolo nº. IACUC2018-0040) no Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati.
1. Instalação de equipamentos e reagentes para a preparação da suspensão das células testiculares
- Prepare cada estoque de enzimas na Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks e armazene a -20 °C.(Tabela1).
NOTA: Prepare-se a qualquer momento antes do experimento. - Um dia antes do experimento: Reveste tubos coletores (tubos de 1,5 mL) com soro bovino fetal (FBS) a 4 °C durante a noite.
- No dia do experimento: Coloque o banho d....
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Resultados
Um resultado representativo deste protocolo de classificação é mostrado na Figura 3. O tempo total de triagem de dois testículos (um rato) é geralmente em torno de 3 horas, o que depende da concentração da suspensão celular e da velocidade de classificação. Após a triagem, a pureza dos espermatocitodos é confirmada pela imunossuagem de SYCP3 e γH2AX (Figura 3A). As frações representativas de L/Z, P, D espermatocyte estão em torno de 80,4%, 90,6% e 87,6%, respect.......
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Discussão
Aqui apresentamos um protocolo prático e simples para isolar subpopulações de espermatotozóides e espermatóides de um único rato adulto. Para garantir a reprodutibilidade deste protocolo, existem algumas etapas críticas que precisam de atenção. Antes da digestão enzimápica, a etapa de lavagem visa remover células intersticiais; após a digestão, esta etapa ajuda a remover espermatozoides e detritos. Lavar/centrifugar 3 vezes é importante. Em nossa receita tampão de dissociação, a combinação de várias enzimas diferentes fa.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros dos laboratórios Namekawa, Yoshida e Maezawa pela ajuda; Katie Gerhardt para a edição do manuscrito; Mary Ann Handel por compartilhar o anticorpo H1T, o Núcleo de Citometria de Fluxo de Fluxo do Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC) para compartilhar os equipamentos FACS suportados pelo NIH S10OD023410; Subvenção em Auxílio para Pesquisa Científica (KAKENHI; 17K07424) para T.N.; Bolsa de Pós-Doutorado da Fundação Lalor para a A.S.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) para S.Y.; o Projeto de Pesquisa Grant pela Divisão de Serviços de Pesquisa da Universidade de Azabu, Programa de Branding de Pesquisa da Universidade Privada (2016-2019), Grant-in-Ai....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de 1,5 ml | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Placa de Petri | Corning, Falcon | 351029 | |
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Watson | 1332-015S | |
| Tubo de poliestireno de 5 ml com tampa de pressão do filtro de células (35 µ m malha de nylon) | Corning, Falcon | 352235 | |
| Tubo de centrífuga de 50 mL | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm placa de Petri | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µ m malha de nylon | Corning, Falcon | 352350 | |
| Classificador de células | Sony | SH800S | |
| Centrífuga | |||
| Colgenase, recombinante, sem origem animal | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Colgenase, Tipo 1 | Worthington | LS004196 | |
| Vidro de cobertura | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato) | Fisher | D1306 | : 0,1 μ g/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Soro de burro | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t anticorpo | presente de Mary Ann Handel | 1/2000 diluído | |
| Hank' s solução salina balanceada (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hialuronidase de testículos bovinos | Sigma | H3506-1G | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipetadores | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| anticorpo rH2AX | Millipore | 05-635 | concentração de trabalho: 2 μ g/mL |
| Proteína de Fertilização de Esperma 56 (Sp56) anticorpo | QED Bioscience | 55101 | concentração de trabalho: 0,5 μ g/mL |
| Esterilizado fórceps | |||
| Superfrost /Plus Lâminas de Microscópio | Fisher | 12-550-15 | |
| Anticorpo SYCP3 | Abcam | ab205846 | concentração de trabalho: 5 μ g / mL |
| TWEEN 20 (Polissorbato 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Banho-maria |
Referências
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives ....
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