Summary

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Published: January 14, 2021
doi:

Summary

Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.

Abstract

O isolamento dos espermatocitotas meioticos é essencial para investigar mecanismos moleculares subjacentes à meiose e espermatogênese. Embora existam protocolos de isolamento celular estabelecidos usando manchas hoechst 33342 em combinação com a classificação celular ativada pela fluorescência, ela requer classificadores celulares equipados com um laser ultravioleta. Aqui descrevemos um protocolo de isolamento celular usando a mancha DyeCycle Violet (DCV), um corante de ligação de DNA de baixa citotoxicidade estruturalmente semelhante ao Hoechst 33342. O DCV pode ser animado por lasers ultravioleta e violeta, o que melhora a flexibilidade da escolha do equipamento, incluindo um classificador de células não equipado com um laser ultravioleta. Usando este protocolo, pode-se isolar três subpopulações de células vivas em prophase I meiotic, incluindo leptoteno/zygotene, paquitene e espermatocitotes diploteno, bem como espermatoides redondos pós-meioticos. Também descrevemos um protocolo para preparar suspensão de célula única de testículos de mouse. No geral, o procedimento requer um curto período de tempo para ser concluído (4-5 horas, dependendo do número de células necessárias), o que facilita muitas aplicações a jusante.

Introduction

A espermatogênese é um processo complexo em que uma pequena população de células-tronco espermatogonial sustenta a produção contínua de um grande número de espermatozoides ao longo da vida adulta1,2. Durante a espermatogênese, a remodelação dinâmica da cromatina ocorre quando as células espermatogênicas sofrem meiose para produzir espermatóides haploides3,4,5. O isolamento dos espermatocitos meioticos é essencial para a investigação molecular, e várias abordagens diferentes para isolados espermatotocitos meioticos foram estabelecidas, incluindo separação baseada em sedimentação6,7 e triagem celular ativada por fluorescência (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. No entanto, esses métodos têm limitações técnicas. Enquanto a separação baseada em sedimentação produz um grande número de células5,6,7, é trabalhosa. O método estabelecido baseado em FACS usa hoechst 33342 (Ho342) para separar espermatocitotas meioticos com base no conteúdo de DNA e propriedades de dispersão de luz e requer classificadores de células FACS equipados com um laser ultravioleta (UV)8,9,10,11. Métodos alternativos baseados em FACS requerem linhas de camundongos transgênicos que expressam proteínas florescentes, sincronização da espermatogênese12, ou fixação celular e rotulagem de anticorpos que não são compatíveis com o isolamento das células vivas13. Embora exista outro método alternativo usando um corante de ligação de DNA permeável celular, DyeCycle Mancha verde14,15,16,17, este método é recomendado para o isolamento de células espermatogênicas de testis juvenis. Portanto, há uma necessidade crítica de desenvolver um método de isolamento simples e robusto para espermatos meioticos vivos que podem ser aplicados a qualquer cepa de camundongos de qualquer idade e que pode ser realizado usando qualquer classificador de células FACS.

Aqui descrevemos um protocolo de isolamento celular tão procurado usando a mancha DyeCycle Violet (DCV). DCV é uma baixa citotoxicidade, corante de dna permeável celular estruturalmente semelhante ao Ho342, mas com um espectro de excitação deslocado para a faixa violeta18. Além disso, o DCV tem um espectro de emissões mais amplo em comparação com o DCG. Assim, ele pode ser animado por lasers UV e violeta, o que melhora a flexibilidade do equipamento, permitindo o uso de um classificador de células FACS não equipado com um laser UV. O protocolo DCV apresentado aqui usa separação bidimensional com azul DCV e vermelho DCV, imitando a vantagem do protocolo Ho342. Com essa vantagem, nosso protocolo DCV nos permite isolar células germinativas altamente enriquecidas dos testíis adultos. Fornecemos um protocolo de gating detalhado para isolar células espermatogênicas vivas de testículos de camundongos adultos de um rato (de dois testículos). Também descrevemos um protocolo eficiente e rápido para preparar a suspensão unicelular a partir de testículos de mouse que podem ser usados para este isolamento celular. O procedimento requer um curto período de tempo para ser concluído (preparação de suspensão de célula única – 1 hora, coloração de corante – 30 min, e classificação celular – 2-3 horas: total – 4-5 horas, dependendo do número de células necessárias; Figura 1). Após o isolamento celular, uma ampla gama de aplicações a jusante, incluindo RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq e cultura celular podem ser concluídas.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (protocolo nº. IACUC2018-0040) no Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati. 1. Instalação de equipamentos e reagentes para a preparação da suspensão das células testiculares Prepare cada estoque de enzimas na Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks e armazene a -20 °C.(Tabela1).NOTA: Prepare-se a qualquer momento antes do experimento. Um dia an…

Representative Results

Um resultado representativo deste protocolo de classificação é mostrado na Figura 3. O tempo total de triagem de dois testículos (um rato) é geralmente em torno de 3 horas, o que depende da concentração da suspensão celular e da velocidade de classificação. Após a triagem, a pureza dos espermatocitodos é confirmada pela imunossuagem de SYCP3 e γH2AX (Figura 3A). As frações representativas de L/Z, P, D espermatocyte estão em torno de 80,4%, 90,6% …

Discussion

Aqui apresentamos um protocolo prático e simples para isolar subpopulações de espermatotozóides e espermatóides de um único rato adulto. Para garantir a reprodutibilidade deste protocolo, existem algumas etapas críticas que precisam de atenção. Antes da digestão enzimápica, a etapa de lavagem visa remover células intersticiais; após a digestão, esta etapa ajuda a remover espermatozoides e detritos. Lavar/centrifugar 3 vezes é importante. Em nossa receita tampão de dissociação, a combinação de várias …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos membros dos laboratórios Namekawa, Yoshida e Maezawa pela ajuda; Katie Gerhardt para a edição do manuscrito; Mary Ann Handel por compartilhar o anticorpo H1T, o Núcleo de Citometria de Fluxo de Fluxo do Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC) para compartilhar os equipamentos FACS suportados pelo NIH S10OD023410; Subvenção em Auxílio para Pesquisa Científica (KAKENHI; 17K07424) para T.N.; Bolsa de Pós-Doutorado da Fundação Lalor para a A.S.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) para S.Y.; o Projeto de Pesquisa Grant pela Divisão de Serviços de Pesquisa da Universidade de Azabu, Programa de Branding de Pesquisa da Universidade Privada (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) e a Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) para S.M.; Instituto Nacional de Saúde R01 GM122776 para S.H.N.

Materials

1.5 ml tube Watson 131-7155C
100 mm Petri dish Corning, Falcon 351029
15 mL Centrifuge tube Watson 1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) Corning, Falcon 352235
50 mL Centrifuge tube Watson 1342-050S
60 mm Petri dish Corning, Falcon 351007
70 µm nylon mesh Corning, Falcon 352350
Cell sorter Sony SH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-free FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 036-23141
Collagenase, Type 1 Worthington LS004196
Cover glass Fisher 12-544-G
Cytospin 3 Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Fisher D1306 working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase I Sigma D5025-150KU
Donkey serum Sigma S30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885076
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000044
Hostone H1T antibody gift from Mary Ann Handel 1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS) Gibco 14175095
Hyaluronidase from bovine testes Sigma H3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher P36930
rH2AX antibody Millipore 05-635 working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody QED Bioscience 55101 working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope Slides Fisher 12-550-15
SYCP3 antibody Abcam ab205846 working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20) Sigma P9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) Invitrogen V35003
Water bath

Referências

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Yeh, Y., Hu, M., Nakagawa, T., Sakashita, A., Yoshida, S., Maezawa, S., Namekawa, S. H. Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye. J. Vis. Exp. (167), e61666, doi:10.3791/61666 (2021).

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