JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming

Published: December 04, 2020
doi:
10.3791/61671
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems,Tel-Aviv University

Summary

De gepresenteerde methode omvat het uniaxiaal uitrekken van 3D zachte hydrogels ingebed in siliconenrubber terwijl live confocale microscopie mogelijk is. Karakterisering van de externe en interne hydrogelstammen en vezeluitlijning worden gedemonstreerd. Het ontwikkelde apparaat en protocol kunnen de reactie van cellen op verschillende stamregimes beoordelen.

Abstract

Externe krachten zijn een belangrijke factor bij weefselvorming, ontwikkeling en onderhoud. De effecten van deze krachten worden vaak bestudeerd met behulp van gespecialiseerde in vitro rekmethoden. Verschillende beschikbare systemen maken gebruik van 2D substraat-gebaseerde brancards, terwijl de toegankelijkheid van 3D-technieken om zachte hydrogels te belasten, beperkter is. Hier beschrijven we een methode die het mogelijk maakt om zachte hydrogels van hun omtrek extern uit te rekken, met behulp van een elastische siliconenstrip als monsterdrager. Het stretching-systeem dat in dit protocol wordt gebruikt, is opgebouwd uit 3D-geprinte onderdelen en goedkope elektronica, waardoor het eenvoudig en gemakkelijk te repliceren is in andere laboratoria. Het experimentele proces begint met het polymeriseren van dikke (>100 μm) zachte fibrine hydrogels (Elastische Modulus van ~100 Pa) in een uitsparing in het midden van een siliconenstrip. Siliconengelconstructies worden vervolgens aan het bedrukte rekapparaat bevestigd en op het confocale microscoopstadium geplaatst. Onder live microscopie wordt het rekapparaat geactiveerd en worden de gels op verschillende rekgroottes afgebeeld. Beeldverwerking wordt vervolgens gebruikt om de resulterende gelvervormingen te kwantificeren, waarbij relatief homogene stammen en vezeluitlijning worden aangetoond over de 3D-dikte van de gel(Z-as). Voordelen van deze methode zijn onder meer de mogelijkheid om extreem zachte hydrogels in 3D te belasten tijdens het uitvoeren van in situ microscopie, en de vrijheid om de geometrie en grootte van het monster te manipuleren volgens de behoeften van de gebruiker. Bovendien kan deze methode met de juiste aanpassing worden gebruikt om andere soorten hydrogels (bijv. collageen, polyacrylamide of polyethyleenglycol) uit te rekken en kan het mogelijk zijn om cellen en weefselrespons op externe krachten te analyseren onder meer biomimetische 3D-omstandigheden.

Introduction

Weefselrespons op mechanische krachten is een integraal onderdeel van een breed scala aan biologische functies, waaronder genexpressie1, celdifferentiatie2en weefselremodellering3. Bovendien kunnen door kracht geïnduceerde veranderingen in de extracellulaire matrix (ECM) zoals vezeluitlijning en verdichting het celgedrag en weefselvormingbeïnvloeden 4,5,6. De vezelige meshstructuur van het ECM heeft intrigerende mechanische eigenschappen, zoals niet-lineaire elasticiteit, niet-affine vervorming en plastische vervormingen7,8,9,10,11,12. Deze eigenschappen beïnvloeden hoe cellen en hun omringende micromilieu reageren op externe mechanische krachten13,14. Inzicht in hoe het ECM en weefsels reageren op mechanische krachten zal vooruitgang mogelijk maken op het gebied van weefseltechnologie en in de ontwikkeling van nauwkeurigere computationele en theoretische modellen.

De meest voorkomende methoden om monsters mechanisch uit te rekken, hebben zich gericht op met cellen beladen 2D-substraten om de effecten op celgedrag te onderzoeken. Deze omvatten bijvoorbeeld het toepassen van stam op polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten en het analyseren van celheroriëntatiehoeken ten opzichte van de rekrichting15,16,17,18,19. Toch zijn methoden die de reactie van 3D-celgeïnteceerde hydrogels op externe stretch onderzoeken, een situatie die weefselmicromilieu nauwer nabootst, beperkter. Vooruitgang in de richting van 3D-rekmethoden is van bijzonder belang omdat cellen zich anders gedragen op 2D-substraten in vergelijking met 3D-matrices20. Deze gedragingen omvatten cellulaire herschikking, eiwitexpressieniveaus en migratiepatronen21,22,23.

Methoden en apparaten die het uitrekken van 3D-monsters mogelijk maken , omvatten zowel in de handel verkrijgbare24,25,26,27,28 als die welke zijn ontwikkeld voor laboratoriumonderzoek29. Deze methoden gebruiken opgezette siliconen buizen30,multi-well kamers31,klemmen 26,32,bioreactoren11,33,cantilevers34,35,36,en magneten37,38. Sommige technieken genereren stretch die lokaal 3D-hydrogels vervormt, bijvoorbeeld door naalden van twee enkele punten in de gel te trekken5, terwijl andere vervorming van het hele grootste deel van de gel mogelijk maken16. Bovendien richten de meeste van deze systemen zich op de analyse van het spanningsveld in het X-Y-vlak, met beperkte informatie over het spanningsveld in de Z-richting. Bovendien zijn slechts een handvol van deze apparaten in staat tot microscopische beeldvorming in situ. De grootste uitdaging bij in situ high-magnification imaging (bijv. confocale microscoop) is de beperkte werkafstand van enkele honderden micron van de objectieve lens tot het monster. Apparaten die live beeldvorming tijdens stretch mogelijk maken, offeren de uniformiteit van de spanning in de Z-asop of zijn relatief complex en moeilijk te reproduceren in andere laboratoria39,40.

Deze benadering van stretch 3D hydrogels zorgt voor statische of cyclische uniaxiale belasting tijdens live confocale microscopie. Het rekapparaat (aangeduid als ‘Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS’) is gemaakt van 3D-geprinte onderdelen en goedkope hardware, waardoor eenvoudige reproductie in andere laboratoria mogelijk is. Aan het apparaat is een in de handel verkrijgbaar siliconenrubber bevestigd met een geometrische uitsparing in het midden. Hydrogelcomponenten worden gepolymeriseerd om de uitsparing te vullen. Tijdens polymerisatie hechten biologische hydrogels, zoals fibrine of collageen, zich van nature aan de binnenwanden van de uitsparing. Met behulp van de SCyUS wordt de siliconenstrip uniaxiaal uitgerekt, waardoor gecontroleerde stammen worden overgebracht naar de ingebedde 3D-hydrogel41.

Dit systeem maakt een unieke combinatie van functies en voordelen mogelijk in vergelijking met andere bestaande methoden. Ten eerste maakt het systeem eenassige rek mogelijk van dikke 3D-zachte hydrogels (>100 μm dik, <1 kPa-stijfheid) uit hun periferie, met Z-homogenevervorming door de hydrogel. Deze hydrogels zijn te zacht om vast te pakken en uitgerekt te worden door conventionele trektechnieken. Ten tweede kan het rekapparaat gemakkelijk worden gerepliceerd in andere laboratoria, omdat 3D-printen direct beschikbaar is voor onderzoekers en de elektronica die in het ontwerp wordt gebruikt goedkoop is. Ten derde, en misschien wel het meest aantrekkelijke kenmerk, kunnen de geometrie en de grootte van de uitsparing in de siliconenstrip gemakkelijk worden gemanipuleerd, waardoor afstembare stamgradiënten en randvoorwaarden mogelijk zijn, evenals het gebruik van een verscheidenheid aan monstervolumes, tot een paar microliters.

Het gepresenteerde protocol bestaat uit het vormen van fibrinegel in schijven met een diameter van ~ 2 mm in 0,5 mm dikke siliconenrubberstrips die worden uitgevoerd door eenassige stretch onder levende confocale microscopie. Het volgende bespreekt in detail de experimentele procedures voor het meten en analyseren van de stammen die werken op de geometrische uitsparing, de interne stammen die in de hydrogel zijn ontwikkeld, evenals de resulterende vezeluitlijning na verschillende rekmanipulaties. Ten slotte wordt de mogelijkheid besproken om cellen in de hydrogel te verankeren en bloot te stellen aan gecontroleerde externe stretch.

Protocol

1. Oplossingsvoorbereiding (vooraf uit te voeren) Fibrinogeen labelingOPMERKING: De etiketteerstap is alleen vereist als het analyseren van de vervorming van de fibrinegel gewenst is. Voor cellulaire experimenten is het mogelijk om een niet-gelabelde gel te gebruiken. Voeg 38 μL 10 mg/ml succinimidylester fluorescerende kleurstof (opgelost in DMSO) toe aan 1,5 ml fibrinogeenoplossing van 15 mg/ml (molaire verhouding van 5:1) in een centrifugebuis van 50 ml en plaats deze gedurende 1 uur op een shak…

Representative Results

Representatieve gegevens van statische rek van toenemende omvang toegepast op de siliconen strip met een 3D fibrine hydrogel, ingebed met 1 μm fluorescerende kralen, wordt weergegeven in figuur 9. De analyse toont het effect van siliconen stretch op geometrische veranderingen van de cut-out en de ontwikkelde stammen in de gel. Z-stackafbeeldingen van de gehele gel worden gebruikt om de vervorming van de oorspronkelijke cirkelvormige uitsnede van de elliptische geometrie te…

Discussion

De methode en het protocol die hierin worden gepresenteerd, zijn grotendeels gebaseerd op onze eerdere studie door Roitblat Riba et al.41 We nemen hier het volledige computerondersteunde ontwerp (CAD), Python en microcontrollercodes van het SCyUS-apparaat op.

De belangrijkste voordelen van de gepresenteerde methode ten opzichte van bestaande benaderingen zijn de mogelijkheid om zeer zachte 3D-hydrogels (Elastische Modulus van ~ 100 Pa) uit hun omtrek te belaste…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sommige figuren hier zijn aangepast met toestemming van het Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Spannen van 3D-hydrogels met uniforme z-asstammen terwijl live microscopiebeeldvorming mogelijk wordt, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor – TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. . Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

Tags

Keywords: 3D HydrogelsLive Microscopy ImagingMechanical CuesBiomechanical ResponsesHydrogel GeometryCell ResponseExtracellular MatrixDisease ProgressionCancer TherapiesFibrin GelFibrinogenThrombinPBSStretching DeviceSilicone Strip
check_url/pt/61671?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image