JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Kontrollerad stam av 3D-hydrogeler under levande mikroskopiavbildning

Published: December 04, 2020
doi:
10.3791/61671
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems,Tel-Aviv University

Summary

Den presenterade metoden innebär enaxial sträckning av 3D mjuka hydrogeler inbäddade i silikongummi samtidigt som levande konfokal mikroskopi tillåts. Karakterisering av de yttre och inre hydrogelstammarna samt fiberjustering demonstreras. Enheten och protokollet som utvecklats kan bedöma cellernas reaktion på olika stamregimer.

Abstract

Yttre krafter är en viktig faktor i vävnadsbildning, utveckling och underhåll. Effekterna av dessa krafter studeras ofta med hjälp av specialiserade in vitro-stretchingmetoder. Olika tillgängliga system använder 2D-substratbaserade bårar, medan tillgängligheten till 3D-tekniker för att spänna mjuka hydrogeler är mer begränsad. Här beskriver vi en metod som möjliggör extern sträckning av mjuka hydrogeler från deras omkrets, med hjälp av en elastisk silikonremsa som provbärare. Stretchsystemet som används i detta protokoll är konstruerat av 3D-printade delar och billig elektronik, vilket gör det enkelt och enkelt att replikera i andra labb. Den experimentella processen börjar med polymerisering av tjocka (>100 μm) mjuka fibrinhydrogeler (Elastisk Modulus på ~ 100 Pa) i en utskärning i mitten av en silikonremsa. Silikongelkonstruktioner fästs sedan på den tryckta sträckningsanordningen och placeras på det konfokala mikroskopstadiet. Under levande mikroskopi aktiveras sträckanordningen och gelerna avbildas med olika stretchstorlekar. Bildbehandling används sedan för att kvantifiera de resulterande geldeformationerna, vilket visar relativt homogena stammar och fiberjustering genom hela geléns 3D-tjocklek(Z-axel). Fördelarna med denna metod inkluderar förmågan att spänna extremt mjuka hydrogeler i 3D medan du utför in situ-mikroskopi och friheten att manipulera provets geometri och storlek enligt användarens behov. Dessutom, med korrekt anpassning, denna metod kan användas för att sträcka andra typer av hydrogeler (t.ex. kollagen, polyakrylamid eller polyetylenglykol) och kan möjliggöra analys av celler och vävnadsrespons på yttre krafter under mer biomimetiska 3D-förhållanden.

Introduction

Vävnadsrespons på mekaniska krafter är en integrerad del av ett brett spektrum av biologiska funktioner, inklusivegenuttryck 1, cell differentiering2, och vävnadsrenovering3. Dessutom kan kraftinducerade förändringar i den extracellulära matrisen (ECM) såsom fiberjustering och förtätning påverka cellbeteende och vävnadsbildning4,5,6. ECM: s fibrösa nätstruktur har spännande mekaniska egenskaper, såsom icke-linjär elasticitet, icke-affindeformation och plastdeformationer7,8,9,10,11,12. Dessa egenskaper påverkar hur celler och deras omgivande mikromiljö reagerar på yttre mekaniska krafter13,14. Att förstå hur ECM och vävnader reagerar på mekaniska krafter kommer att möjliggöra framsteg inom vävnadsteknik och i utvecklingen av mer exakta beräknings- och teoretiska modeller.

De vanligaste metoderna för att mekaniskt sträcka prover har fokuserat på cellbelastade 2D-substrat för att utforska effekterna på cellbeteendet. Dessa inkluderar till exempel att applicera stam på pdms-substrat (polydimethylsiloxane) och analysera cellreorienteringsvinklar i förhållande till sträckriktningen15,16,17,18,19. Ändå är metoder som undersöker 3D-cellinbäddade hydrogelers svar på yttre stretch, en situation som närmare efterliknar vävnadsmikromiljö, mer begränsade. Framsteg mot 3D-sträckningsmetoder är av särskild betydelse eftersom celler beter sig annorlunda på 2D-substrat jämfört med 3D-matriser20. Dessa beteenden inkluderar cellulär omjustering, proteinuttrycksnivåer och migreringsmönster21,22,23.

Metoder och anordningar som möjliggör 3D-provsträckning inkluderar bådekommersiellt tillgängliga 24,25,26,27,28 och de som utvecklats för laboratorieforskning29. Dessa metoder använder distensible silikonrör30,multi-well kammare31,klämmor26,32,bioreaktorer11,33,cantilevers34,35,36, och magneter37,38. Vissa tekniker genererar sträckning som lokalt deformerar 3D-hydrogeler, till exempel genom att dra nålar från två enda punkter i gelén5, medan andra tillåter deformation av hela huvuddelen av gelén16. Dessutom fokuserar de flesta av dessa system på analys av belastningsfältet i X-Y-planet, med begränsad information om belastningsfältet i Z-riktningen. Dessutom kan endast en handfull av dessa enheter mikroskopisk in situ-avbildning. Den största utmaningen med in situ-avbildning med hög förstoring (t.ex. konfokalt mikroskop) är det begränsade arbetsavståndet på några hundra mikrometer från objektivlinsen till provet. Anordningar som tillåter levande avbildning under stretch offrar enhetligheten av belastningen i Z-axelneller är relativt komplexa och svåra att reproducera i andralaboratorier 39,40.

Detta tillvägagångssätt för att sträcka 3D hydrogeler möjliggör statisk eller cyklisk enaxial stam under levande confocal mikroskopi. Sträckanordningen (kallad Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS) är konstruerad med 3D-utskrivna delar och billig hårdvara, vilket möjliggör enkel reproduktion i andra laboratorier. Fäst vid enheten är ett kommersiellt tillgängligt silikongummi med en geometrisk utskärning i mitten. Hydrogelkomponenter polymeriseras för att fylla utskärningen. Under polymerisationen fäster biologiska hydrogeler, såsom fibrin eller kollagen, naturligt på skärningens innerväggar. Med hjälp av SCyUS är silikonremsan uniaxiellt sträckt och överför kontrollerade stammar till den inbäddade 3D-hydrogelen41.

Detta system möjliggör en unik kombination av funktioner och fördelar jämfört med andra befintliga metoder. För det första tillåter systemet enaxial sträckning av tjocka 3D mjuka hydrogeler (>100 μm tjock, <1 kPa styvhet) från periferin, med Z-homogendeformation i hela hydrogelen. Dessa hydrogeler är för mjuka för att greppas och sträckas av konventionella draghållfasta tekniker. För det andra kan sträckningsenheten enkelt replikeras i andra laboratorier eftersom 3D-utskrift är lätt tillgänglig för forskare och elektroniken som används i designen är billig. För det tredje, och kanske den mest attraktiva funktionen, kan geometrin och storleken på utskärningen i silikonremsan lätt manipuleras, vilket möjliggör tunable stamgradienter och gränsförhållanden samt användning av en mängd olika provvolymer, ner till några mikroliter.

Det presenterade protokollet består av gjutning fibrin gel i ~ 2 mm diameter skivor i 0,5 mm tjocka silikon gummiremsor som fortsätter av enaxial stretch under levande confocal mikroskopi. Följande diskuterar i detalj de experimentella förfarandena för att mäta och analysera stammarna som verkar på den geometriska utskärningen, de inre stammarna som utvecklats i hydrogelen, samt resulterande fiberjustering efter olika sträckmanipulationer. Slutligen diskuteras möjligheten att bädda in celler i hydrogelen och utsätta dem för kontrollerad extern sträckning.

Protocol

1. Lösningsberedning (ska utföras i förväg) Fibrinogen märkningOBS: Märkningssteget krävs endast om du vill analysera deformationen av fibringelen. För cellulära experiment är det möjligt att använda en omärkt gel. Tillsätt 38 μL 10 mg/ml succinimidylesterinfluensa (upplöst i DMSO) till 1,5 ml 15 mg/mL fibrinogenlösning (molarförhållande på 5:1) i ett 50 mL centrifugerör och placera på en skakapparat i 1 timme vid rumstemperatur. Placera därefter röret i centrifugen i 3 minut…

Representative Results

Representativa data från statisk sträcka av ökande magnitud som appliceras på silikonremsan med en 3D-fibrinhydrogel, inbäddad med 1 μm fluorescerande pärlor, visas i figur 9. Analysen visar effekten av silikonsträcka på geometriska förändringar av utskärningen samt de utvecklade stammarna i gelén. Z-stackbilder av hela gelén används för att utvärdera deformationen av den ursprungliga cirkelformade utskärningen till den elliptiska geometrin (<strong class=…

Discussion

Metoden och protokollet som presenteras häri är till stor del baserade på vår tidigare studie av Roitblat Riba et al.41 Vi inkluderar här den fullständiga datorstödda designen (CAD), Python och mikrokontrollerkoderna för SCyUS-enheten.

De stora fördelarna med den presenterade metoden jämfört med befintliga metoder inkluderar möjligheten att spänna mycket mjuka 3D-hydrogeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) från deras omkrets och under levande</e…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Några siffror som ingår här har anpassats med tillstånd från Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019) sila 3D-hydrogeler med enhetliga z-axelstammar samtidigt som de möjliggör levande mikroskopiavbildning.

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor – TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. . Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

Tags

3D HydrogelsLive Microscopy ImagingMechanical CuesBiomechanical ResponsesHydrogel GeometryCell ResponseExtracellular MatrixDisease ProgressionCancer TherapiesFibrin GelFibrinogenThrombinPBSStretching DeviceSilicone Strip

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image