Este protocolo apresenta ensaio de brotos de choroide, um modelo ex vivo de proliferação microvascular. Este ensaio pode ser usado para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais e avaliar tratamentos medicamentosos usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.
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Artigo de método
Um Ensaio Ex Vivo Choroid de Angiogênese Microvascular Ocular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Angiogênese choroicular patológica, uma característica marcante da degeneração macular relacionada à idade, leva à deficiência visual e cegueira. Ensaios de proliferação de células endoteliais (CE) utilizando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) ou CEs de retina primária isolada são amplamente utilizados em modelos in vitro para estudar angiogênese retinária. No entanto, isolar as células endoteliais da retina murina pura é tecnicamente desafiador e os CEs da retina podem ter respostas de proliferação diferentes das células endoteliais choroidais e diferentes interações celular/celular. Um ensaio altamente reprodutível ex vivo choroidal como modelo de proliferação microvascular choroidal foi desenvolvido. Este modelo inclui a interação entre vasculatura choroide (CE, macrófagos, pericílitos) e epitélio pigmento da retina (RPE). As explantas de RPE/coroid/scleral do mouse são isoladas e incubadas no extrato de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento (BME) (dia 0). O meio é trocado a cada dois dias e o broto de coroide é quantificado no dia 6. As imagens da explanta choroide individual são tiradas com um microscópio de fase invertida e a área de broto é quantificada usando um plug-in macro semi-automatizado para o software ImageJ desenvolvido neste laboratório. Este ensaio reprodutível de broto ex vivo choroidal pode ser usado para avaliar compostos para tratamento potencial e para pesquisas de doenças microvasculares para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.
Introdução
A desregulação da angiogênese choroidal está associada à degeneração macular relacionada à idade neovascular (DM)1. O coroide é um leito microvascular presente sob o epitélio pigmento da retina (RPE). Foi demonstrado que a redução do fluxo sanguíneo no coroide está associada à progressão da AMD2. A intrincada relação entre endotélio vascular, RPE, macrófagos, pericítos e outras células é responsável pela homeostase do tecido3,4,5. Portanto, um ensaio reprodutível modelando microambiente choroidal é fundamental para o estudo da A....
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Protocolo
Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil de Boston (protocolo ARCH número 19-04-3913R).
1. Preparação
- Adicione 5 mL de Penicillin/Streptomycin (10000 U/mL) e 5 mL e 10 mL de suplementos disponíveis comercialmente a 500 mL de meio clássico completo com soro. Alíquota de 50 mL do meio inicialmente.
NOTA: Não devolva nenhum meio de volta ao estoque para evitar contaminação. - Coloque uma alíquota de meio clássico completo no gelo.
- Use 70% de etanol para limpar o microscópio de dissecação, fórceps e tesouras.
- Pr....
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Resultados
Comparação do crescimento de brotos de coroides por dia
Dissecamos o coroide com esclera, embutido na BME e os cultuamos por 6 dias(Figura 1). Os brotos de coroide em camundongos C57BL/6J do dia 3 ao dia 6 foram examinados com um microscópio e quantificados com SWIFT-Choroid um método de quantificação semi-automatizado no ImageJ. Em um caso representativo, a área de broto choroidal (os vasos que se estendem da explanta, excluindo a própria explant.......
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Discussão
O ensaio de brotação de choroida ajuda a pesquisa em AMD neovascular9,10,18,19,20. Explantas choroides podem ser isoladas de camundongos, bem como ratos e humanos17,21. A explantação coroide inclui CES, macrófagos e pericítes17. Neste ensaio, a interação entre os CEs choroidal e.......
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Divulgações
Os autores não têm divulgações financeiras. O método informatizado está disponível gratuitamente para instituições acadêmicas através dos autores.
Agradecimentos
O trabalho foi apoiado por subsídios da Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ofthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship e Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; ao BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AnaSed (Xilazina) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Extrato de membrana basal (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Placa de cultura de células | NEST | 704001 | 10cm |
| Meio clássico completo com soro e sistemas celulares CultureBoost | 4Z0-500 | ||
| Álcool etílico 200 Prova | Pharmco | 111000200 | uso para 70% |
| Microscópio Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| ZEISS | Axio Observer Z1 | ||
| Penicilina/Estreptomicina | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Placa de cultura de tecidos (24 poços) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Cetamina) | AKORN | 59399-114-10 |
Referências
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Oph....
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Reimpressões e permissões
