यहां हम जेब्राफ़िश न्यूट्रोफिल में chemoattractant रिसेप्टर गतिशीलता के लाइव इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं
रासायनिक gradients द्वारा ल्यूकोसाइट मार्गदर्शन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक है। न्यूट्रोफिल पहली कोशिकाएं हैं जिन्हें ऊतक क्षति की साइटों पर भर्ती किया जाता है जहां वे महत्वपूर्ण रोगाणुरोधी कार्यों को निष्पादित करते हैं। इन लोकी के लिए उनकी तस्करी कई भड़काऊ chemoattractants, केमोकिन्स सहित द्वारा orchestrated है। आणविक स्तर पर, chemoattractant सिग्नलिंग संबंधित रिसेप्टर्स के इंट्रासेल्युलर तस्करी द्वारा विनियमित किया जाता है। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि केमोकाइन रिसेप्टर्स में उपकोशिकीय परिवर्तन सेल और ऊतक स्तर पर ल्यूकोसाइट माइग्रेशन गतिशीलता को कैसे प्रभावित करते हैं। यहां हम ऊतक क्षति के लिए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान न्यूट्रोफिल में केमोकाइन रिसेप्टर गतिशीलता के लाइव इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं। इन उपकरणों से पता चला है कि ज़ेबराफ़िश न्यूट्रोफिल में विभेदक केमोकाइन रिसेप्टर तस्करी ऊतक क्षति के स्थलों पर न्यूट्रोफिल क्लस्टरिंग और फैलाव का समन्वय करती है। यह हमारी समझ के लिए निहितार्थ है कि कैसे भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को आत्म-हल किया जाता है। वर्णित उपकरणों का उपयोग विभिन्न प्रकार की शारीरिक और पैथोलॉजिकल सेटिंग्स में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन पैटर्न को समझने के लिए किया जा सकता है और कार्यप्रणाली को अन्य सिग्नलिंग रिसेप्टर्स तक बढ़ाया जा सकता है।
ल्यूकोसाइट माइग्रेशन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए सर्वोपरि महत्व का है। प्रतिरक्षा कोशिकाएं प्रोटोटाइपिक प्रवासी कोशिकाएं हैं, जो ऊतकों और रक्त वाहिकाओं को पार करने में उल्लेखनीय रूप से सक्षम हैं और सूक्ष्मजीवों या महत्व के अन्य मेजबान कोशिकाओं की ओर दिशात्मक रूप से स्थानांतरित करने के लिए रासायनिक मार्गदर्शन संकेतों की एक श्रृंखला को संवेदी करती हैं। सही मार्गदर्शन chemoattractants की मान्यता पर निर्भर करता है, जिनमें से केमोकिन्स सबसे प्रमुख श्रेणी1 का प्रतिनिधित्व करते हैं। केमोकाइन्स को अत्यधिक विशिष्ट सात-ट्रांसमेम्ब्रेन जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स द्वारा पहचाना जाता है। केमोकाइन बाइंडिंग पर, केमोकाइन रिसेप्टर्स संरचना को बदलते हैं जिससे संबंधित ट्राइमेरिक जी प्रोटीन के सक्रियण और कार्यात्मक सिग्नलिंग सबयूनिट्स में उनके पृथक्करण होते हैं जो साइटोस्केलेटल परिवर्तनों को बढ़ावा देते हैं और माइग्रेशन1 को निर्देशित करते हैं। दूसरे, केमोकाइन रिसेप्टर्स फॉस्फोराइलेटेड होते हैं, और यह संशोधन आकर्षित करने के लिए असंवेदनशीलता की ओर जाता है, जिसके बाद तेजी से पुन: संवेदीकरण / रीसाइक्लिंग या इंट्रासेल्युलर गिरावट और सेल सतह2 से नीचे-विनियमन किया जा सकता है। ये रिसेप्टर गतिशीलता कोशिकाओं द्वारा प्राप्त सिग्नलिंग की अवधि और खुराक को प्रभावित करती है, लेकिन वे ल्यूकोसाइट माइग्रेशन व्यवहार को कैसे प्रभावित करते हैं, विवो में स्पष्ट करना मुश्किल है।
पारंपरिक स्तनधारी प्रणालियों में लाइव ल्यूकोसाइट्स में रिसेप्टर गतिशीलता को ट्रैक करना कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। लाइव अध्ययन के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ रिसेप्टर संलयन को कोशिकाओं में व्यक्त किया जाना चाहिए। यह प्राथमिक ल्यूकोसाइट्स में चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से न्यूट्रोफिल में, और अब तक के अध्ययनों ने केमोकाइन रिसेप्टर्स 3,4 को व्यक्त करने के लिए सरोगेट न्यूट्रोफिल सेल लाइनों का उपयोग किया है। ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की पीढ़ी, जिसमें ल्यूकोसाइट्स सूचनात्मक तस्करीदोषों 5,6 के साथ एक फ्लोरोसेंट रिसेप्टर या उत्परिवर्ती रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं, समय और संसाधनों के काफी निवेश पर जोर देता है। यहां तक कि इन उदाहरणों में, जीवित जानवर में इमेजिंग रिसेप्टर गतिशीलता के लिए इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट सीमित हो सकता है और अध्ययनों ने निश्चित ऊतक अनुभागों5 पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग किया है। इन तकनीकी चुनौतियों को देखते हुए, कैसे chemoattractant रिसेप्टर्स गतिशीलता एक जीवित ऊतक सेटिंग में सेल व्यवहार को प्रभावित करने की हमारी समझ वर्तमान में सीमित है।
यहां हम ज़ेबराफ़िश न्यूट्रोफिल में रिसेप्टर तस्करी की निगरानी करने के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं। ज़ेबराफ़िश आनुवंशिक रूप से असभ्य हैं, चूहों की तरह, लेकिन ट्रांसजेनेसिस कुशल ट्रांसपोसन सिस्टम और प्रत्यक्ष युग्मनज हेरफेर7 के उपयोग के माध्यम से अपेक्षाकृत अधिक सीधा है। पारदर्शी लार्वा आदर्श रूप से इमेजिंग के लिए उपयुक्त है। केमोकाइन रिसेप्टर गतिशीलता को प्राथमिक रोगाणु कोशिकाओं और पार्श्व रेखा आदिम में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर 8,9,10 के साथ संबंधित संलयन की अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना की गई है। ज़ेबराफ़िश लार्वा परिपक्व न्यूट्रोफिल से सुसज्जित होते हैं जिनमें स्तनधारी न्यूट्रोफिल के संबंध में अत्यधिक संरक्षित आनुवंशिक और सेलुलर गुण होते हैं। साइटोस्केलेटल गतिशीलता और ध्रुवीयता नियामकों जैसे उपकोशिकीय सिग्नलिंग गतिशीलता को इन कोशिकाओं में संबंधित ट्रांसजेनिक लाइनों11,12,13 की पीढ़ी द्वारा कल्पना की गई है। हाल ही में, हमने ऊतक क्षति14 के लिए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान न्यूट्रोफिल में केमोकाइन रिसेप्टर गतिशीलता की कल्पना और कार्यात्मक रूप से विश्लेषण किया। यहां, हम न्यूट्रोफिल में केमोकाइन सिग्नलिंग के लिए ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों की पीढ़ी का वर्णन करते हैं, लाइव इमेजिंग के लिए भ्रूण की तैयारी, न्यूट्रोफिल सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक घाव परख और छवियों के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल। हम उम्मीदवार लिगेंड के लिए केमोकाइन रिसेप्टर प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए एक साइड-प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं, जो कि अज्ञात रिसेप्टर्स में लिगैंड मान्यता पैटर्न स्थापित करने की कोशिश करते समय उपयोगी होता है। इन तकनीकों का उपयोग आगे आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ संयोजन में किया जा सकता है, जैसे कि अंतर्जात केमोकाइन अभिव्यक्ति का निषेध या परिवर्तित लिगैंड-प्रेरित तस्करी के साथ उत्परिवर्ती रिसेप्टर्स की पीढ़ी, यह पूछताछ करने के लिए कि विशिष्ट सिग्नलिंग गतिशीलता विवो में ल्यूकोसाइट व्यवहार को कैसे प्रभावित करती है। फ्लोरोसेंटली टैग किए गए केमोकाइन रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग अंतर्जात केमोकाइन ग्रेडिएंट के लिए रिपोर्टर के रूप में भी किया जा सकता है, जो अन्यथा प्रत्यक्ष एंटीबॉडी धुंधला द्वारा पता लगाना मुश्किल है। वर्णित पद्धति अन्य इम्यूनो-सिग्नलिंग रिसेप्टर्स के लिए पत्रकारों की पीढ़ी का विस्तार करने के लिए गुंजाइश प्रदान करती है।
वर्णित विधि ऊतक क्षति के लिए एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान सीटू में अंतर्जात लिगेंड के जवाब में रिसेप्टर गतिशीलता की लाइव इमेजिंग की अनुमति देती है। Cxcr1 / Cxcr2 न्यूट्रोफिल पत्रकारों के उपयोग को अन्य शारीरिक सेटिंग्स में विस्तारित किया जा सकता है, जैसे कि संक्रमण, ट्यूमर मॉडल या अन्य प्रकार के ऊतक क्षति 14,25,26,27। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक बचाव लाइनें, जिसमें अंतर्जात रिसेप्टर को एक बहिर्जात उत्परिवर्ती रिसेप्टर द्वारा दबाया और बचाया जाता है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में विशिष्ट न्यूट्रोफिल माइग्रेशन पैटर्न के महत्व को विच्छेदित करने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, Cxcr1 रिसेप्टर उत्परिवर्ती है कि बिगड़ा desensitization सूजन साइटों पर अधिक प्रमुख न्यूट्रोफिल क्लस्टरिंग का कारण बनताहै 14. फ़ंक्शन फेनोटाइप के इस लाभ का उपयोग विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं में न्यूट्रोफिल मंडली की भूमिका को समझने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, घाव की मरम्मत, संक्रामक रोग, या ट्यूमर विकास, और पूरक रिसेप्टर नॉकडाउन / नॉकआउट प्रयोग। यह पद्धति उपलब्ध संवाददाताओं की सीमा का विस्तार करने के लिए एक आधार भी प्रदान करती है। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की पसंद पर विचार करना महत्वपूर्ण है और जैविक प्रश्न पर निर्भर करता है। हमने पाया कि उपकला कोशिकाओं की तुलना में न्यूट्रोफिल में इन केमोकाइन रिसेप्टर्स का संरचनात्मक कारोबार उच्च था, और तेजी से परिपक्वता (जैसे, एसएफजीएफपी) वाले पत्रकारों को स्थिर स्थिति में झिल्ली के स्तर की रिपोर्ट करने और न्यूट्रोफिल उत्तेजना 8,14 पर मतभेदों को हल करने की आवश्यकता थी। इस प्रकार, sfGFP / tagRFP के झिल्ली अनुपात इस सेल प्रकार में लिगैंड-प्रेरित आंतरिककरण को मापने के लिए लागू नहीं होते हैं, लेकिन टैगआरएफपी का पैटर्न रिसेप्टर के इंट्रासेल्युलर भाग्य को ट्रैक करने की अनुमति देता है, जो कुछ अध्ययनों में उपयोगी हो सकता है। हमने यह भी पाया कि टैगआरएफपी का अधिक केंद्रित इंट्रासेल्युलर सिग्नल व्यक्तिगत लार्वा की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है। प्लाज्मा झिल्ली पर रिसेप्टर के स्तर को मापने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण न्यूट्रोफिल में एक फ्लोरोसेंट झिल्ली मार्कर को सह-व्यक्त करना होगा या तो एक ही ट्रांसजीन9 में या एक स्वतंत्र ट्रांसजीन14 में। पूर्व परिदृश्य में ट्रांसजीन मछली और अभिव्यक्ति के स्तर की जांच के लिए एक अतिरिक्त साधन प्रदान करेगा, जो मार्कर और रिसेप्टर के बीच तुलनीय होगा। उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण अधिक मॉड्यूलर होगा, जिसमें एक रिसेप्टर रिपोर्टर के साथ एक ज़ेबराफ़िश लाइन को विभिन्न रिपोर्टर लाइनों के साथ जोड़ा जा सकता है। किसी भी मामले में, यह ध्यान देने योग्य है कि रिसेप्टर के स्तर की झिल्ली परिमाणीकरण संकुल न्यूट्रोफिल में चुनौतीपूर्ण है (नीचे देखें)। अंत में, हम ध्यान देते हैं कि इस प्रोटोकॉल का एक संभावित विस्तार अधिक विस्तृत स्थानीयकरण विश्लेषण के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा लाइव इमेजिंग का पालन करना होगा।
टॉल 2 ट्रांसजेनेसिस सिस्टम अच्छी तरह से स्थापितहै 7 और लाइसोजाइम सी प्रमोटर का उपयोग न्युट्रोफिल अभिव्यक्ति11,15 के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। इसलिए, ट्रांसजेनेसिस दृष्टिकोण अपेक्षाकृत सीधा है और इस प्रमोटर के साथ प्राप्त अभिव्यक्ति का स्तर रिसेप्टर गतिशीलता के विश्लेषण के लिए पर्याप्त विपरीत प्रदान करने के लिए पर्याप्त उच्च है। एक संभावित सीमा यह है कि अभिव्यक्ति का स्तर अंतर्जात रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर को दोहराता नहीं है। नई CRISPR प्रौद्योगिकियों को विशेष रुचि के रिसेप्टर्स के लिए नॉक-इन लाइनों को स्थापित करने के लिए तैनात किया जा सकताहै। ये प्रौद्योगिकियां अभी भी बोझिल हैं और उपकोशिकीय इमेजिंग के लिए आवश्यक अभिव्यक्ति के स्तर की गारंटी नहीं दे सकती हैं, लेकिन उनका सफल विकास अंतर्जात सिग्नलिंग गतिशीलता को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण सफलता होगी। ट्रांसजेनिक रिसेप्टर निर्माणों के साथ डेटा की व्याख्या करने के लिए कार्यात्मक सत्यापन महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, लिगैंड मान्यता एसेस का उपयोग यह स्थापित करने के लिए किया जा सकता है कि फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन कार्यात्मक है और नॉकआउट फेनोटाइप के बचाव का उपयोग यह स्थापित करने के लिए किया जा सकता है कि ट्रांसजेनिक न्यूट्रोफिल अभिव्यक्ति का स्तर कार्यक्षमता14 के साथ संगत है। अंत में, रिसेप्टर संलयन को मान्य करने का एक और अधिक सीधा तरीका गैर-लेबल संस्करणों14 के साथ लेबल किए गए रिसेप्टर के साथ एक इन विट्रो कार्यात्मक परख का उपयोग करना होगा।
परिमाणीकरण दृष्टिकोण विवो में न्यूट्रोफिल में सटीक झिल्ली विभाजन में विशिष्ट कठिनाइयों को संबोधित करता है। उपकला प्रकृति की कोशिकाओं में, रिसेप्टर स्तरों के परिमाणीकरण को झिल्ली रिसेप्टर के स्तर को नियंत्रण मार्कर में सामान्य करके स्वचालित रूप से निष्पादित किया जा सकता है, जिसे अग्रानुक्रम या अलग से9 में व्यक्त किया जा सकता है। दरअसल, हमने इस तरह के एक दृष्टिकोण को लागू किया है, जब गैस्ट्रूलेटिंग भ्रूण14 में लिगैंड-मान्यता परख का उपयोग किया जाता है। हालांकि, न्यूट्रोफिल विवो में सेल के आकार में जटिल, तेजी से परिवर्तन से गुजरते हैं, जिससे झिल्ली विभाजन 2 डी और 3 डी14 दोनों में मुश्किल हो जाता है। यह और भी चुनौतीपूर्ण है जब न्युट्रोफिल क्लस्टर, जो कई शारीरिक सेटिंग्स29 में होता है। कंट्रास्ट मीट्रिक इस सीमा को दूर करता है क्योंकि इसे झिल्ली विभाजन की आवश्यकता नहीं होती है, बल्कि इसके बजाय सेल में रिसेप्टर वितरण की समग्र स्थिति को दर्शाता है (झिल्लीदार / चिकनी बनाम वेसिकुलर / डॉटी)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कंट्रास्ट मीट्रिक छवि के समग्र विपरीत से प्रभावित हो सकता है, इसलिए विभिन्न भ्रूणों / नमूनों में संकेत की परिवर्तनशीलता के लिए आंतरिक संदर्भ के लिए व्यक्तिगत सेल मूल्यों के सामान्यीकरण की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, हमने CHT में गैर-उत्तरदायी न्यूट्रोफिल के माध्य सेल कंट्रास्ट मूल्य का उपयोग किया (यानी, न्यूट्रोफिल जो स्थिर रहते हैं और वेंट्रल फिन में माइग्रेट नहीं करते हैं)14। एक अतिरिक्त संभावना एक ही सेल में एक नियंत्रण मार्कर के विपरीत मूल्यों के साथ सामान्य करने के लिए होगी। यह एक समाधान प्रदान करेगा जब गैर-प्रतिक्रिया देने वाली कोशिकाओं का एक आंतरिक संदर्भ उपलब्ध नहीं होता है और संभवतः विभिन्न स्थितियों के बीच रिसेप्टर गतिशीलता में महीन मात्रात्मक अंतर को हल कर सकता है।
इमेजिंग का स्थान विचार करने के लिए एक और चर है। यहां वेंट्रल फिन घाव को चुनने का कारण, जैसा कि अधिक आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले पूंछ पंख घाव मॉडल16,30 के विपरीत है, क्योंकि घाव की साइट न्युट्रोफिल निवास / प्रवासी मूल की साइट के पास है। यह परख की समयरेखा को तेज करता है, क्योंकि न्यूट्रोफिल को आने में अपेक्षाकृत कम समय लगता है। साथ ही, यह माइग्रेशन मूल (CHT) और ब्याज (घाव) के लक्ष्य स्थान दोनों पर सेल व्यवहार को कैप्चर करने का अवसर प्रदान करता है। यह यहां प्रासंगिक है, क्योंकि उपकोशिकीय इमेजिंग के लिए आवश्यक स्थानिक और अस्थायी रिज़ॉल्यूशन को दृश्य या बहु-स्थिति स्कैनिंग के एक बड़े क्षेत्र के साथ जोड़ना मुश्किल है। इस प्रकार, वेंट्रल फिन घाव परख माइग्रेशन मूल से प्रवासी प्रतिक्रिया के विकास की ट्रैकिंग और कोशिकाओं में अनिर्दिष्ट रिसेप्टर उतार-चढ़ाव के एक साथ कैप्चरिंग की अनुमति देता है जो प्रतिक्रिया नहीं करते हैं। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, उत्तरार्द्ध परिमाणीकरण उद्देश्यों के लिए उपयोगी है क्योंकि यह अविशिष्ट गतिशीलता के लिए एक आंतरिक संदर्भ प्रदान करता है। अन्य प्रणालियों में, इस तरह के आंतरिक संदर्भ का होना संभव नहीं हो सकता है, इस मामले में सह-व्यक्त झिल्ली मार्कर के विपरीत मूल्य एक वैकल्पिक नियंत्रण प्रदान करेंगे।
संक्षेप में, हम उम्मीद करते हैं कि कार्यप्रणाली अन्य प्रणालियों पर लागू होती है और इसे विभिन्न उद्देश्यों के लिए तैनात किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक ही रिपोर्टर का उपयोग अन्य भड़काऊ सेटिंग्स में किया जा सकता है, जैसे कि संक्रमण सेटिंग्स या अन्य रोग मॉडल। ज़ेब्राफ़िश रिसेप्टर रिपोर्टर लाइनों के प्रदर्शनों की सूची को अन्य सिग्नलिंग रिसेप्टर्स में विस्तारित किया जा सकता है, सिग्नलिंग तंत्र को समझने या विवो में लिगैंड गतिशीलता की रिपोर्ट करने के लिए। दृष्टिकोण को नॉकडाउन / नॉकआउट तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि मनाया गतिशीलता के यांत्रिक आधार से पूछताछ की जा सके। उदाहरण के लिए, लिगैंड अभिव्यक्ति की गड़बड़ी मनाया रिसेप्टर गतिशीलता के लिए लिगैंड निर्भरता का संकेत दे सकती है। भविष्य में, हम परिकल्पना करते हैं कि पत्रकारों के नॉक-इन सम्मिलन को शामिल करने के लिए सिस्टम को और परिष्कृत किया जा सकता है। आखिरकार, इस पद्धति का उपयोग करने वाले निष्कर्ष जेब्राफ़िश समुदाय से परे मूल्यवान उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करेंगे, स्तनधारियों में इन सिग्नलिंग रिसेप्टर्स के संरक्षण और बड़े जीवों में इन अध्ययनों के संचालन की सापेक्ष चुनौती को देखते हुए।
The authors have nothing to disclose.
हम Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ मदद के लिए क्रिस्टीन होल्ट और बिल हैरिस को धन्यवाद देते हैं। हम फ्लोरोसेंट टाइमर बैकबोन निर्माणों के लिए डैरेन गिल्मर और टॉल 2-लिज़ बैकबोन वेक्टर के लिए अन्ना हटेनलोचर को धन्यवाद देते हैं। हम Tg (mpx: GFP) i114 लाइन के लिए स्टीव रेनशॉ को धन्यवाद देते हैं। इस काम को MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] द्वारा समर्थित किया गया था; आइजैक न्यूटन ट्रस्ट [12.21 (ए)i] और एक आइजैक न्यूटन ट्रस्ट अनुदान 19.23 (एन)। सी.C एक एमआरसी डीटीपी छात्र द्वारा समर्थित था और आंशिक रूप से वेलकम ट्रस्ट [204845 / जेड / 16 / जेड] द्वारा; आइजैक न्यूटन ट्रस्ट [12.21 (ए)i] अनुदान। एचडब्ल्यू को एमआरसी डीटीपी स्टूडेंटशिप द्वारा समर्थित किया गया था। एचपी को वेलकम ट्रस्ट पीएचडी अनुदान (105391 / जेड / 14 / जेड) द्वारा और आंशिक रूप से वेलकम ट्रस्ट [204845 / जेड / 16 / जेड] द्वारा समर्थित किया गया था; आइजैक न्यूटन ट्रस्ट [12.21 (ए)i] अनुदान और एमआरसी (एमआर / एल019523 / 1)।
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |