Her beskriver vi protokoller for å utføre levende avbildning og kvantitativ analyse av kjemoattractant reseptordynamikk i sebrafisk nøytrofiler
Leukocyttveiledning ved kjemiske gradienter er avgjørende for immunresponser. Nøytrofiler er de første cellene som rekrutteres til steder med vevsskade der de utfører viktige antimikrobielle funksjoner. Deres handel til disse loci er orkestrert av flere inflammatoriske kjemoattractants, inkludert kjemokiner. På molekylært nivå reguleres kjemoattractantsignalering av intracellulær smugling av de tilsvarende reseptorene. Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan subcellulære endringer i kjemokinreseptorer påvirker leukocyttmigrasjonsdynamikken på celle- og vevsnivå. Her beskriver vi en metodikk for levende avbildning og kvantitativ analyse av kjemokinreseptordynamikk i nøytrofiler under inflammatoriske responser på vevsskade. Disse verktøyene har avslørt at differensial kjemokinreseptorhandel i sebrafisk nøytrofiler koordinerer nøytrofilklynge og spredning på steder med vevsskade. Dette har implikasjoner for vår forståelse av hvordan inflammatoriske responser er selvavklart. De beskrevne verktøyene kan brukes til å forstå nøytrofil migrasjonsmønstre i en rekke fysiologiske og patologiske omgivelser, og metodikken kan utvides til andre signalreseptorer.
Leukocyttmigrasjon er av avgjørende betydning for immunresponser. Immunceller er prototypiske trekkceller, som er bemerkelsesverdig i stand til å krysse vev og blodkar og registrere en rekke kjemiske veiledningssignaler for å migrere retningsmessig mot mikrober eller andre vertsceller av betydning. Korrekt veiledning er avhengig av anerkjennelse av kjemoattractants, blant annet kjemokiner representerer den mest fremtredende kategori1. Kjemokiner er anerkjent av svært spesifikke syv-transmembrane G proteinkoblede reseptorer. Ved kjemokinbinding endrer kjemokinreseptorer konformasjon som fører til aktivering av tilhørende trimeriske G-proteiner og deres dissosiasjon til funksjonelle signalunderenheter som fremmer cytoskeletale endringer og rettet migrasjon1. For det andre er kjemokinreseptorer fosforilert, og denne modifikasjonen fører til desensibilisering til tiltrekkende, som kan etterfølges av rask re-sensibilisering / resirkulering eller intracellulær nedbrytning og nedregulering fra celleoverflaten2. Disse reseptordynamikkene påvirker varigheten og dosen av signalering mottatt av cellene, men hvordan de påvirker leukocyttmigrasjonsadferd har vært vanskelig å belyse in vivo.
Sporing av reseptordynamikk i levende leukocytter i tradisjonelle pattedyrsystemer står overfor flere utfordringer. For levende studier må reseptorfusjoner med fluorescerende proteiner uttrykkes i cellene. Dette er utfordrende i primære leukocytter, spesielt i nøytrofiler, og studier så langt har brukt surrogat nøytrofile cellelinjer for å uttrykke kjemokinreseptorer 3,4. Generering av transgene musemodeller, der leukocytter uttrykker en fluorescerende reseptor eller mutantreseptorer med informative trafficking defekter 5,6, innebærer betydelig investering av tid og ressurser. Selv i disse tilfellene kan bildeoppløsningen og kontrasten for avbildningsreseptordynamikk i det levende dyret begrenses, og studier har brukt immunhiistokjemi på fast vevsseksjon5. Gitt disse tekniske utfordringene, er vår forståelse av hvordan kjemoattractant reseptordynamikk påvirker celleadferd i en levende vevsinnstilling for tiden begrenset.
Her tilbyr vi en metodikk for å overvåke reseptorhandel i sebrafisk nøytrofiler. Sebrafisk er genetisk gjennomførbare, som mus, men transgenese er relativt enklere ved bruk av effektive transposonsystemer og direkte zygotemanipulering7. Den gjennomsiktige larven er ideelt egnet til avbildning. Kjemokinreseptordynamikken har blitt visualisert i primordiale bakterieceller og sidelinjen primordium ved uttrykk for tilsvarende fusjoner med fluorescerende reportere 8,9,10. Sebrafisk larver er utstyrt med modne nøytrofiler som har høyt bevarte genetiske og cellulære egenskaper med hensyn til pattedyr nøytrofiler. Subcellulær signaldynamikk som cytoskeletal dynamikk og polaritetsregulatorer har blitt visualisert i disse cellene ved generering av tilsvarende transgene linjer 11,12,13. Nylig visualiserte og funksjonelt analyserte vi kjemokinreseptordynamikk i nøytrofiler i løpet av inflammatoriske responser på vevsskade14. Her beskriver vi genereringen av transgene reporterlinjer for kjemokinsignalering i nøytrofiler, fremstilling av embryoer for levende avbildning, en såranalyse for å studere nøytrofilsignalering og protokollen for oppkjøp og analyse av bilder. Vi tilbyr også en sideprotokoll for å teste kjemokinreseptorresponser på kandidatliginer, noe som er nyttig når du prøver å etablere ligandgjenkjenningsmønstre i ukarakteriserte reseptorer. Disse teknikkene kan brukes i kombinasjon med ytterligere genetiske manipulasjoner, for eksempel hemming av endogene kjemokinuttrykk eller generering av mutante reseptorer med endret ligandindusert menneskehandel, for å forhøre hvordan spesifikk signaldynamikk påvirker leukocytt atferd in vivo. De transgene linjene som uttrykker fluorescerende taggede kjemokinreseptorer kan også brukes som reportere for endogene kjemokingradienter, som ellers er vanskelige å oppdage ved direkte antistofffarging. Den beskrevne metodikken gir rom for å utvide genereringen av reportere til andre immunsignalerende reseptorer.
Metoden som er beskrevet tillater levende avbildning av reseptordynamikk som svar på endogene ligander in situ under en inflammatorisk respons på vevsskade. Bruken av Cxcr1/Cxcr2 nøytrofile reportere kan utvides til andre fysiologiske omgivelser, for eksempel infeksjon, tumormodeller eller andre typer vevsskader 14,25,26,27. I tillegg kan transgene redningslinjer, der den endogene reseptoren undertrykkes og reddes av en eksogen mutantreseptor, gi nyttige verktøy for å dissekere viktigheten av spesifikke nøytrofil migrasjonsmønstre i immunresponser. For eksempel forårsaker Cxcr1-reseptormutanter som har nedsatt desensibilisering mer fremtredende nøytrofilklynge på inflammatoriske steder14. Denne gevinsten av funksjon fenotype kan brukes til å forstå rollen som nøytrofil menighet i ulike fysiologiske prosesser, for eksempel sårreparasjon, smittsom sykdom eller tumorutvikling, og utfylle reseptor knockdown / knockout eksperimenter. Metodikken gir også grunnlag for å utvide utvalget av tilgjengelige reportere. Valget av fluorescerende reporter er viktig å vurdere og avhenger av det biologiske spørsmålet. Vi fant at den konstituerende omsetningen av disse kjemokinreseptorene i nøytrofiler var høy, sammenlignet med epitelceller, og at reportere med rask modning (f.eks. sfGFP) var pålagt å rapportere membrannivåer ved steady state og løse forskjeller ved nøytrofilstimulering 8,14. Dermed er membranforhold av sfGFP / tagRFP ikke aktuelt for måling av ligandindusert internalisering i denne celletypen, men mønsteret til tagRFP tillater sporing av reseptorens intracellulære skjebner, noe som kan være nyttig i noen studier. Vi fant også ut at det mer konsentrerte intracellulære signalet til tagRFP er nyttig for screening av individuelle larver. En alternativ tilnærming for måling av reseptornivåer ved plasmamembranen ville være å uttrykke en fluorescerende membranmarkør i nøytrofiler enten i samme transgene9 eller i en uavhengig transgene14. I det tidligere scenariet ville transgene gi et ekstra middel for å screene fisken og uttrykksnivåene ville være sammenlignbare mellom markøren og reseptoren. Sistnevnte tilnærming ville være mer modulær, ved at en sebrafisklinje med en reseptorreporter kunne kombineres med forskjellige reporterlinjer. I begge tilfeller er det verdt å merke seg at membran kvantifisering av reseptornivåene er utfordrende i klyngede nøytrofiler (se nedenfor). Til slutt merker vi oss at en mulig forlengelse av denne protokollen ville være å følge opp levende avbildning av immunhiistokjemi for mer detaljerte lokaliseringsanalyser.
Tol2 transgenese systemet er godt etablert7 og lysozyme C promotoren har blitt brukt mye for nøytrofil uttrykk11,15. Transgenesetilnærmingen er derfor relativt grei, og uttrykksnivået som oppnås med denne promotoren er høyt nok til å gi tilstrekkelig kontrast til analyse av reseptordynamikk. En mulig begrensning er at uttrykksnivået ikke rekapitlerer endogene reseptoruttrykksnivåer. Nye CRISPR-teknologier kan distribueres for å etablere knock-in linjer for reseptorer av spesiell interesse28. Disse teknologiene er fortsatt tungvint og garanterer kanskje ikke de nødvendige uttrykksnivåene for subcellulær avbildning, men deres vellykkede utvikling vil være et viktig gjennombrudd for å forstå endogen signaldynamikk. Funksjonell validering er viktig for å tolke data med transgene reseptorkonstruksjoner. For eksempel kan ligandgjenkjenningsanalyser brukes til å fastslå at det fluorescerende fusjonsproteinet er funksjonelt og redning av knockout-fenotyper kan brukes til å fastslå at de transgene nøytrofiluttrykksnivåene er kompatible med funksjonalitet14. Endelig ville en mer direkte måte å validere reseptorfusjonen være å bruke en in vitro funksjonell analyse med merket reseptor sammen med ikke-merkede versjoner14.
Kvantifiseringsmetoden tar for seg spesifikke vanskeligheter med nøyaktig membransegmentering i nøytrofiler in vivo. I celler av epitel natur kan kvantifisering av reseptornivåer utføres automatisk ved å normalisere membranreseptornivåer til en kontrollmarkør, som kan uttrykkes i tandem eller separat9. Faktisk har vi brukt en slik tilnærming, når vi bruker ligandgjenkjenningsanalysen i gastrulaterende embryoer14. Imidlertid gjennomgår nøytrofiler komplekse, raske endringer i celleform in vivo, noe som gjør membransegmenteringen vanskelig både i 2D og 3D14. Dette er enda mer utfordrende når nøytrofiler klynger, som forekommer i mange fysiologiske innstillinger29. Kontrastmetrikken overvinner denne begrensningen da den ikke krever membransegmentering, men gjenspeiler i stedet den generelle tilstanden til reseptorfordeling i cellen (membranøs / glatt vs vesikulær / prikk). Det er viktig å merke seg at kontrastmetrikk kan påvirkes av bildets generelle kontrast, så normalisering av individuelle celleverdier til en intern referanse er nødvendig for å ta hensyn til variasjon av signal i forskjellige embryoer / prøver. For eksempel brukte vi den gjennomsnittlige cellekontrastverdien til ikke-responsive nøytrofiler i CHT (dvs. nøytrofiler som forblir stasjonære og ikke migrerer inn i ventralfinen)14. En ekstra mulighet ville være å normalisere med kontrastverdier av en kontrollmarkør i samme celle. Dette vil gi en løsning når en intern referanse til celler som ikke svarer, ikke er tilgjengelig, og sannsynligvis kan løse finere kvantitative forskjeller i reseptordynamikk mellom ulike forhold.
Plasseringen av avbildning er en annen variabel å vurdere. Årsaken til å velge ventralfinsår her, i motsetning til den mer brukte halefinne sårmodellen 16,30, er fordi stedet for sår er i nærheten av stedet for nøytrofil bolig / trekkende opprinnelse. Dette akselererer tidslinjen til analysen, da det tar relativt lite tid for nøytrofiler å ankomme. I tillegg gir det muligheten til å fange celleadferd både ved migrasjonsopprinnelsen (CHT) og målplasseringen av interesse (sår). Dette er relevant her, fordi den romlige og tidsmessige oppløsningen som kreves for subcellulær avbildning, er vanskelig å kombinere med et stort synsfelt eller skanning med flere posisjoner. Dermed tillater ventral fin såranalyse sporing av utviklingen av migrasjonsresponsen fra migrasjonsopprinnelsen og samtidig fangst av uspesifiserte reseptorsvingninger i celler som ikke reagerer. Som nevnt ovenfor er sistnevnte nyttig for kvantifiseringsformål, da det gir en intern referanse for uspesifisert dynamikk. I andre systemer er det kanskje ikke mulig å ha en slik intern referanse, i så fall vil kontrastverdiene til en med-uttrykt membranmarkør gi en alternativ kontroll.
Oppsummert forventer vi at metodikken gjelder for andre systemer og kan distribueres til en rekke formål. For eksempel kan de samme reporterne brukes i andre inflammatoriske omgivelser, for eksempel infeksjonsinnstillinger eller andre sykdomsmodeller. Repertoaret til sebrafiskreseptorreporterlinjer kan utvides til andre signalreseptorer, for å forstå signalmekanismer eller rapportere liganddynamikk i vivo. Tilnærmingen kan kombineres med knockdown/knockout-teknikker for å forhøre det mekanistiske grunnlaget for observert dynamikk. Perturbasjon av liganduttrykk kan for eksempel angi ligandavhengigheten for observert reseptordynamikk. I fremtiden ser vi for oss at systemet kan bli ytterligere raffinert for å innlemme knock-in innsetting av reportere. Til syvende og sist vil funn som bruker denne metoden gi ny innsikt som er verdifull utover sebrafisksamfunnet, gitt bevaring av disse signalreseptorene hos pattedyr og den relative utfordringen med å gjennomføre disse studiene i større organismer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christine Holt og Bill Harris for hjelp med konfiskert mikroskopi. Vi takker Darren Gilmour for fluorescerende timer ryggrad konstruksjoner og Anna Huttenlocher for Tol2-Lyz ryggraden vektoren. Vi takker Steve Renshaw for Tg(mpx:GFP)i114-linjen . Dette arbeidet ble støttet av MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] og en Isaac Newton Trust-stipend 19.23(n). C.C. ble støttet av et MRC DTP-studentskap og delvis av Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] stipend. H.W. ble støttet av et MRC DTP Studentship. H.P. ble støttet av et Wellcome Trust PhD grant (105391/Z/14/Z) og delvis av en Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] stipend og MRC (MR/L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |