Субретинальная трансплантация ткани сетчатки, полученной из эмбриональных стволовых клеток человека, на модели крупного крупного животного кошки

Summary

Здесь представлена хирургическая техника трансплантации ткани сетчатки, полученной из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), в субретинальное пространство модели крупного животного.

Abstract

Дегенеративные состояния сетчатки (RD), связанные с потерей фоторецепторов, такие как возрастная макулярная дегенерация (AMD), пигментный ретинит (RP) и врожденный амавроз Лебера (LCA), вызывают прогрессирующую и изнурительную потерю зрения. Существует неудовлетворенная потребность в терапии, которая может восстановить зрение после потери фоторецепторов. Трансплантация ткани сетчатки (органоидов), полученной из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), в субретинальное пространство глаза с прогрессирующей РД приносит листы ткани сетчатки с тысячами здоровых фоторецепторов без мутаций и имеет потенциал для лечения большинства / всех слепых заболеваний, связанных с дегенерацией фоторецепторов, с помощью одного утвержденного протокола. Трансплантация ткани сетчатки плода в субретинальное пространство животных моделей и людей с прогрессирующей РД была успешно разработана, но не может использоваться в качестве рутинной терапии из-за этических проблем и ограниченного снабжения тканями. Животные модели наследственной дегенерации сетчатки большого глаза (IRD) ценны для разработки методов восстановления зрения с использованием передовых хирургических подходов к трансплантации клеток / тканей сетчатки в субретинальное пространство. Сходство в размере земного шара и распределении фоторецепторов (например, наличие центральной области макулы), а также наличие моделей IRD, близко повторяющих IRD человека, будет способствовать быстрому переводу многообещающей терапии в клинику. Здесь представлена хирургическая техника трансплантации ткани сетчатки, полученной из hPSC, в субретинальное пространство модели крупного животного, позволяющая оценить этот перспективный подход на животных моделях.

Introduction

Миллионы людей во всем мире страдают от дегенерации сетчатки (РД), что приводит к ухудшению зрения или слепоте, связанной с потерей светочувствительных фоторецепторов (ПР). Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является основной причиной слепоты, возникающей в результате сочетания генетических факторов риска и факторов окружающей среды / образа жизни. Кроме того, было обнаружено, что более 200 генов и локусов вызывают наследственный RD (IRD)¹. Пигментный ретинит (RP), самый распространенный IRD, генетически неоднороден: сообщается о более чем 3000 генетических мутациях примерно в 70 генах ^2,3,4. Врожденный амавроз Лебера (LCA), вызывающий слепоту в детском возрасте, также генетически гетероген ^5,6. Генная аугментационная терапия была разработана и находится в клинических испытаниях для лечения небольшого числа IRD ^3,7. Тем не менее, отдельная терапия должна быть разработана для лечения каждой отдельной генетической формы IRD и, таким образом, лечения только небольшой подгруппы пациентов. Кроме того, аугментация генов основана на наличии популяции восстанавливаемых фоторецепторов и, следовательно, неприменима для прогрессирующей дегенерации.

Таким образом, существует настоятельная и еще неудовлетворенная клиническая потребность в разработке методов лечения, направленных на лечение и лечение прогрессирующих РД и глубокой до неизлечимой слепоты. За последние 2 десятилетия нейропротезные имплантаты были разработаны и испытаны на моделях крупных животных, таких как кошка, до использования человеком 8,9,10,11,12,13,14. Аналогичным образом, за последние 20 лет была разработана заместительная терапия сетчатки с использованием листов эмбриональной или даже зрелой сетчатки млекопитающих, пересаженных субретинально 15,16,17,18,19,20,21,22 и даже успешно протестирована у пациентов с РД ^23,24,25. Оба подхода используют идею введения новых датчиков (фотоэлектрических кремниевых фотодиодов в случае нейропротезов^26,27 и здоровых безмутационных фоторецепторов, организованных в листы^, в случае имплантации листа сетчатки) в сетчатку с дегенерированными PR. В недавних исследованиях изучалось использование подходов, основанных на стволовых клетках, таких как трансплантация предшественников сетчатки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC)^28,29, фоторецепторов hPSC 30 и органоидов сетчатки^{hPSC 31,32,33}. Органоиды сетчатки позволяют формировать ткань сетчатки в чашке и получать фоторецепторные листы с тысячами безмутационных PR, которые напоминают слой фоторецепторов в развивающейся сетчатке плода человека 34,35,36,37,38,39,40. Трансплантация ткани сетчатки (органоидов), полученной из hPSC, в субретинальное пространство пациентов с заболеваниями РД является одним из новых и перспективных исследовательских подходов к клеточной терапии, применяемых рядом команд 31,32,41,42. По сравнению с трансплантацией клеточной суспензии (молодых фоторецепторов или предшественников сетчатки) было продемонстрировано, что трансплантированные листы фоторецепторов плода приводят к улучшению зрения в клинических испытаниях^23,24.

Представленный здесь протокол подробно описывает процедуру трансплантации для субретинальной доставки целых органоидов сетчатки (а не ободков^{органоидов 33,41}) как потенциально лучший способ введения интактных листов сетчатки с PR для увеличения выживаемости трансплантата и улучшения сохранности листа. Несмотря на то, что были разработаны процедуры введения плоского кусочка сетчатки человека, а также пластырей RPE^43,44,45, трансплантация более крупных 3D-трансплантатов не исследовалась. Органоиды сетчатки, полученные из стволовых клеток, являются неисчерпаемым источником фоторецепторных листов для разработки технологий восстановления зрения, свободны от этических ограничений и считаются отличным источником ткани сетчатки человека для терапии, направленной на лечение прогрессирующей РД и терминальной слепоты⁴⁶. Разработка хирургических методов точной субретинальной имплантации органоидов сетчатки с минимальным повреждением ниши сетчатки хозяина (нервная сетчатка, пигментный эпителий сетчатки и сосудистая сеть сетчатки и хориоидеи) является одним из важнейших шагов для продвижения такой терапии к клиническому применению^31,32. Модели крупных животных, таких как кошки, собаки, свиньи и обезьяны, оказались хорошими моделями для исследования хирургических методов доставки, а также для демонстрации безопасности имплантированных листов ткани (клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE)) и исследования использования органоидов 41,44,45,47,48,49,50 . Большой глаз животного имеет размер шара, аналогичный человеческому, а также аналогичную анатомию, включая наличие области высокой плотности фоторецепторов, включая колбочки (область centralis), напоминающую человеческую макулу 6,51,52.

В данной рукописи описана методика имплантации ткани сетчатки (органоидов), полученной из hPSC, в субретинальное пространство кошачьих моделей крупных животных (как дикого типа, так и кошек Crx^Rdy/+), что вместе с многообещающими результатами^{эффективности 32,53} создает основу для дальнейшего развития такой исследуемой терапии для клинического применения для лечения состояний РД.

Protocol

Процедуры проводились в соответствии с заявлением Ассоциации по исследованиям в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Они также были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их ис?…

Representative Results

Эта процедура обеспечивает успешную и воспроизводимую имплантацию органоидов сетчатки, полученных из hPSC, в субретинальное пространство модели крупного глаза животного (продемонстрировано здесь на 2 примерах: кошки дикого типа со здоровыми фоторецепторами (PR) и кошки CrxRdy/+<…

Discussion

Имплантация ткани сетчатки, полученной из hPSC (органоидов сетчатки), в субретинальное пространство является перспективным экспериментальным подходом к восстановлению зрения при дегенеративных заболеваниях сетчатки на поздних стадиях, вызванных гибелью клеток PR (глубокая или термина?…

Materials

0.22 µm pore syringe filter with PES membrane	Cameo	NA	can be found by various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula	DORC	1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe	Hamilton	NA	can be found by various suppliers
6-0 Silk suture	Ethicon	707G
6-0/7-0 polyglactin suture	Ethicon	J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject)	Henry Schein Animal Health	NA	can be found by various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Par Pharmaceutical	NA	can be found by various suppliers
cSLO + SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine	Novartis	NA	can be found by various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium)	Vetone	NA	can be found by various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL	Cipla	NA	can be found by various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarnital solution)	Vortech	NA	can be found by various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL	Hospira	NA	can be found by various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing	World Precision Instruments	TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL	Pfizer	NA	can be found by various suppliers
Microscope	Zeiss	NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound)	Sakura	4583
Olympic Vac-Pac Size 23	Natus	NA	can be found by various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution	EMS	15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Propofol 5000mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)	Zoetis	NA	can be found by various suppliers
RetCam II video fundus camera	Clarity Medical Systems	NA	can be found by various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40)	Bristol -Myers Squibb Company	NA	can be found by various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Vitrectomy 23G port	Alcon	Accurus systems
Vitrectomy machine	Alcon	Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle	Frimen	FT170206T