הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן
Summary
בעוד התנגשויות מזלג שכפול עם צינורות DNA יכול לגרום לשברים גדיל כפול, פחות ידוע על האינטראקציה בין replisomes וחסימת נגעים. השתמשנו במבחן קשירת הקרבה כדי להמחיש מפגשים אלה ולאפיין את ההשלכות על קומפוזיציה רפלימית.
Abstract
תובנה משמעותית קיימת לגבי התגובה התאית לשברי גדיל כפול (DSB), הנגרמים על ידי נוקלאזות, קרינה ומפסקי דנ”א אחרים. בין השאר, הדבר משקף את זמינותן של שיטות לזיהוי אתרי הפסקה, ואת אפיון הגורמים שגויסו ל-DSB ברצפים אלה. עם זאת, DSBs מופיעים גם כמתווכים במהלך עיבוד של צינורות DNA שנוצרו על ידי תרכובות שאינן גורמות ישירות להפסקות, ואינן מגיבות באתרי רצף ספציפיים. כתוצאה מכך, עבור רוב סוכנים אלה, טכנולוגיות המאפשרות ניתוח של אינטראקציות קשירה עם גורמי תגובה וחלבוני תיקון אינם ידועים. לדוגמה, קישורים צולבים בין גדילי דנ”א (ICLs) יכולים לעורר שברים בעקבות מפגשי מזלג שכפול. למרות שנוצרו על ידי תרופות בשימוש נרחב כמו כימותרפיה סרטן, לא היתה מתודולוגיה לניטור האינטראקציות שלהם עם חלבונים שכפול.
כאן, אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו לעקוב אחר התגובה התאית להתנגשויות מזלג עם adducts מאתגר אלה. קישרנו אנטיגן סטרואידים לפסורלן, היוצר כיל תלוי פוטואקטיבציה בגרעינים של תאים חיים. הכילים הודגמו על ידי אימונופלואורסנציה כנגד תג האנטיגן. התג יכול גם להיות שותף בבדיקת קשירת הקרבה (PLA) המדווחת על קשר הדוק של שני אנטיגנים. ה-PLA נוצל כדי להבדיל בין חלבונים שהיו קשורים קשר הדוק עם כיל מתויגת לבין חלבונים שלא. ניתן היה להגדיר חלבונים רפליזומיים שנשמרו לאחר מפגשים עם כיל ולזהות חלבונים אחרים שאבדו. גישה זו ישימה לכל מבנה או צינור DNA שניתן לזהות באופן אימונולוגי.
Introduction
התגובה התאית לשברים כפולים מתועדת היטב הודות לרצף של שיטות חזקות יותר ויותר להכוונת הפסקות לאתרים גנומיים ספציפיים 1,2,3. ודאות המיקום מאפשרת אפיון חד משמעי של חלבונים וגורמים אחרים המצטברים באתר ומשתתפים בתגובת הנזק לדנ”א (DDR), ובכך מניעים את מסלולי חיבור הקצה הלא הומולוגי (NHEJ) והקומבינציה ההומולוגית (HR) המתקנים שברים. כמובן, הפסקות רבות מוצגות על ידי סוכנים כגון קרינה ומינים כימיים שאינם תוקפים רצפים ספציפיים4. עם זאת, עבור אלה ישנם נהלים זמינים שיכולים להמיר את הקצוות למבנים מקובלים עבור תיוג לוקליזציה 5,6. הפסקות מוצגות גם על ידי תהליכים ביולוגיים, כגון סידור מחדש של אימונוגלובולינים, והטכנולוגיה העדכנית מאפשרת לוקליזציה שלהם, כמו גם7. לאחר מכן ניתן לקבוע את הקשר בין הגורמים המגיבים לבין אתרים אלה.
הפסקות מופיעות גם כתוצאה עקיפה של אדדוקציות הנוצרות על ידי תרכובות שאינן מפסקות אינהרנטיות אלא משבשות עסקאות DNA כגון שעתוק ושכפול. הם עשויים להיווצר כתכונה של התגובה התאית לחסימות אלה, אולי במהלך תיקון או משום שהם מעוררים מבנה פגיע להתקפת נוקלאז. בדרך כלל, הקשר הפיזי בין האדוקט, ההפסקה והקשר עם גורמים מגיבים הוא היסק. לדוגמה, כילים נוצרים על ידי כימותרפיות כגון ציספלטין ומיטומיצין C8 וכתוצר תגובה של אתרים בסיסיים9. מזלגות כיל ידועים כבלוקים חזקים למזלגות שכפול10, ובכך מעכבים מזלגות שניתן לבקע על ידי נוקלאזות11. הקישור הקוולנטי בין הגדילים מוקל לעתים קרובות על ידי מסלולים שיש להם הפסקות מחייבות כביניים 12,13, מה שמחייב רקומבינציה הומולוגית כדי לבנות מחדש את מזלג השכפול14. ברוב הניסויים עוקב החוקר אחר תגובת הגורמים המעניינים להפסקות הנוצרות במורד הזרם של התנגשות מזלג שכפול עם כיל. עם זאת, מכיוון שלא נמצאה טכנולוגיה ללוקליזציה של נגע פרובוקטיבי, ניתן רק להניח את קרבתו של הרפליזום, וחלקיו המרכיבים, לכיל.
פיתחנו אסטרטגיה המאפשרת ניתוח של אסוציאציות חלבוניות עם אדדוקטים קוולנטיים ספציפיים שאינם רצפים, כפי שמודגם כאן על ידי ICLs. במערכת שלנו אלה מוצגים על ידי psoralen, מוצר טבעי פוטואקטיבי המשמש במשך אלפי שנים כטיפול להפרעות עור15. הגישה שלנו מבוססת על שתי תכונות חשובות של פסאורלן. הראשון הוא התדירות הגבוהה שלהם של היווצרות crosslink, אשר יכול לעלות על 90% של adducts, בניגוד פחות מ 10% שנוצרו על ידי תרכובות פופולריות כגון cisplatin או Mitomycin C 8,16. השני הוא נגישות המתחם לצמידות ללא אובדן יכולת הצלבה. קישרנו באופן קוולנטי בין טרימתיל פסאורלן לדיגוקסיגנין (Dig), אימונוטאג ותיק. זה מאפשר זיהוי של adducts psoralen בדנ”א גנומי על ידי immunostaining של תג Dig, והדמיה על ידי immunofluorescence קונבנציונאלי17.
מגיב זה יושם, בעבודתנו הקודמת, לניתוח מפגשי מזלג שכפול עם כיל באמצעות בדיקה מבוססת סיבי DNA16. בעבודה זו מצאנו כי השכפול יכול להימשך מעבר לכיל שלמה. זה היה תלוי בקינאז ATR, אשר מופעל על ידי מתח שכפול. ההפעלה מחדש של השכפול הייתה בלתי צפויה בהתחשב במבנה של מנחת המסוקים המשוכפל CMG. זה מורכב מהטרו-הקסמר MCM (M) היוצר טבעת פעורת היסט סביב גדיל התבנית לסינתזה מובילה של גדיל אשר ננעל על ידי החלבונים של קומפלקס GINS (G, המורכב מ- PSF1, 2, 3 ו- SLD5) ו- CDC45 (C)18. ההצעה כי השכפול יופעל מחדש בצד הדיסטלי של כיל לצד ההתנגשות של הרפליזום טענה לשינוי במבנה הרפליזום. כדי לענות על השאלה אילו רכיבים היו בתשובה בזמן המפגש עם כיל פיתחנו את הגישה המתוארת כאן. ניצלנו את תג Dig כשותף ב-Proximity Ligation Assays (PLA)19 כדי לחקור את הקשר ההדוק של כיל עם חלבונים של replisome20.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שה- PLA היא טכניקה חזקה מאוד, ישנם חששות טכניים שיש לפתור על מנת להשיג תוצאות ברורות וניתנות לשחזור. הנוגדנים חייבים להיות בעלי זיקה גבוהה וספציפיות. יתר על כן, חשוב להפחית את אותות הרקע הלא ספציפיים ככל האפשר. גילינו שקרומים ופסולת תאית תורמים לרקע, והסרנו אותם ככל האפשר. השטיפות עם חו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך, בחלקו, על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלית של ה-NIH, המכון הלאומי להזדקנות, ארצות הברית (Z01-AG000746-08). J.H. נתמך על ידי הקרנות הלאומיות למדעי הטבע של סין (21708007 ו -31871365).
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
Referências
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
- Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
- Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
- Galbiati, A., Beausejour, C., d’Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
- Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
- Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
- Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
- Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
- Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
- Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
- Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
- Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
- Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
- Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- O’Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
- Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
- Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
- Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
- Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
- Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
- Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, 617-624 (2009).
- Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).
