Her presenterer vi en protokoll for adenovirusproduksjon ved hjelp av pAdEasy-systemet. Teknologien inkluderer rekombinasjon av pAdTrack og pAdEasy-1 plasmider, adenovirusemballasje og forsterkning, rensing av adenoviralpartiklene fra cellelysat og kulturmedium, viral titrering og funksjonell testing av adenoviruset.
Adenoviral transduksjon har fordelen av en sterk og forbigående induksjon av uttrykket av genet av interesse til et bredt utvalg av celletyper og organer. Imidlertid er rekombinant adenoviral teknologi arbeidskrevende, tidkrevende og dyr. Her presenterer vi en forbedret protokoll ved hjelp av pAdEasy-systemet for å oppnå rensede adenovirale partikler som kan indusere et sterkt grønt fluorescerende proteinuttrykk (GFP) i transinduserte celler. Fordelene ved denne forbedrede metoden er raskere forberedelse og redusert produksjonskostnad sammenlignet med den opprinnelige metoden utviklet av Bert Vogelstein. Hovedtrinnene i adenoviralteknologien er: (1) rekombinasjonen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier; (2) emballasjen til de adenovirale partiklene; (3) forsterkning av adenoviruset i AD293-celler; (4) rensing av adenovirale partikler fra cellelys og kulturmedium; og (5) viral titrering og funksjonell testing av adenoviruset. Forbedringene av den opprinnelige metoden består av (i) rekombinasjonen i BJ5183-inneholdende pAdEasy-1 ved kjemisk transformasjon av bakterier; (ii) valg av rekombinante kloner med “negative” og “positive” PCR; (iii) transfeksjon av AD293 celler ved hjelp av K2 transfection system for adenoviral emballasje; (iv) utfellingen med ammoniumsulfat av de virale partiklene som frigjøres av AD293-celler i cellekulturmediet; og (v) rensing av viruset ved ett-trinns cesiumklorid diskontinuerlig gradient ultracentrifugation. Et sterkt uttrykk for genet av interesse (i dette tilfellet GFP) ble oppnådd i forskjellige typer transinduserte celler (som hepatocytter, endotelceller) fra ulike kilder (menneske, bovin, murine). Adenoviral-mediert genoverføring representerer et av hovedverktøyene for å utvikle moderne genterapier.
Adenovirus er ikke-utviklede virus som inneholder en nukleocapsid og et dobbeltstrenget lineært DNA-genom1,2,3. Adenovirus kan infisere et bredt spekter av celletyper, og infeksjon er ikke avhengig av aktiv vertscelledeling. Etter infeksjon introduserer adenoviruset sitt genomiske DNA i vertscellekjernen, hvor det forblir epikromosomalt og transkriberer sammen med vertenes gener. Dermed oppnås en minimal potensiell risiko for innsetting av mutagenese eller oncogenes-regulering4,5,6. Det adenovirale genomet blir ikke replikert sammen med vertsgenomet, og dermed fortynnes de adenovirale genene i en delingscellepopulasjon. Blant fordelene med adenoviral transduksjon er det: (i) høye nivåer av transgene uttrykk; (ii) redusert risiko knyttet til integrering av viralt DNA i vertsgenomet, på grunn av episomalt uttrykk; (iii) transduksjon av et bredt utvalg av skille- og ikke-skillende celletyper. De fleste adenovirus som brukes i biomedisinsk forskning er ikke-replikerende, mangler E1 region7,8,9. For produksjonen kreves en cellelinje som leverer E1-sekvensen (for eksempel HEK293). Dessuten ble en ikke-essensiell region for den virale livssyklusen (E3) slettet for å tillate innsetting av en transgene i viralgenomet; andre regioner (E2 og E4) ble ytterligere slettet i noen adenovirus, men i disse tilfellene ble det rapportert et redusert utbytte av adenoviral produksjon og lavt uttrykk for transgene7.
Her presenterer vi en forbedret protokoll for konstruksjon, pakking og rensing av adenovirusene ved hjelp av AdEasy System. Disse forbedringene tillot pakking av adenoviruset på en raskere og mer økonomisk måte sammenlignet med den opprinnelige metoden utviklet av Bert Vogelstein2,10, på grunn av følgende fordeler: (i) rekombinasjonen i BJ5183-inneholdende pAdEasy-1 ved kjemisk transformasjon av bakterier; (ii) valg av rekombinante kloner av PCR; (iii) transfeksjon av AD293 celler ved hjelp av K2 transfection system for adenoviral emballasje; (iv) utfelling av adenovirale partikler fra kulturmediet etter viral emballasje og forsterkning; (v) adenoviral rensing ved hjelp av ett-trinns cesiumklorid (CsCl) gradient ultracentrifugation.
Protokollen for adenovirusproduksjon ved hjelp av AdEasy-systemet (figur 1) består av følgende trinn:
(1) Rekombinasjon av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 i BJ5183 bakterier
(2) Emballasje av adenovirale partikler
(3) Forsterkning av adenoviruset
(4) Rensing av adenovirale partikler fra cellelys og kulturmedium
(5) Adenovirustitrering.
Figur 1: Produksjonsteknologien for adenovirus. Hovedtrinnene i adenoviralteknologien er: (1) Rekombinasjonen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier. De valgte rekombinerte plasmidene forsterkes i DH5α-bakterier og renses deretter; (2) Emballasjen til adenoviralpartiklene i AD293-celler, som produserer adeno-E1-proteiner; (3) Forsterkning av adenoviruset i AD293-celler; (4) Rensing av adenovirale partikler fra cellelyset og kulturmediet ved ultracentrifugation på en CsCl tetthet gradient; (5) Titrering av adenoviruset og den funksjonelle testingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I denne protokollen eksemplifiserte vi teknologien for produksjon av adenoviruset, noe som kan indusere uttrykket av GFP i vertscellene. GFP er allerede satt inn i ryggraden i pAdTrack-CMV-shuttle-vektoren (Addgene #16405), under en annen CMV-promotor og brukes som reportergen (figur 1). Av denne grunn utpekte vi pAdTrack-CMV-vektoren som pAdTrack-GFP, og vi vurderte uttrykket av GFP for demonstrative formål. Foruten GFP-uttrykk, kan systemet brukes til å overekspressere et gen av interesse, som kan klones på de mange kloningsstedene til pAdTrack-CMV. Et gen eller en minigene klonet i pAdTrack-CMV er vanligvis mer effektivt for uttrykksinduksjon sammenlignet med cDNA11. Dataene viste et sterkt GFP-uttrykk i transinduserte celler (som hepatocytter, endotelceller) fra ulike kilder (human, bovin, murine). Adenoviral-mediert genoverføring representerer et av hovedverktøyene for å utvikle moderne genterapier.
Rekombinante adenovirus er et allsidig verktøy for genlevering og uttrykk12,13,14. For å indusere sterkt proteinuttrykk ved adenoviral transduksjon settes kodingssekvensen av genet av interesse inn i genomet til adenoviruset. AdEasy adenoviral system, utviklet i laboratoriet til Bert Vogelstein, består av en ryggrad plasmid (pAdEasy-1) som inneholder det meste av wild-type adenovirus serotype 5 genom, og en shuttle vektor (pAdTrack), designet for gen kloning2,10. Slettingen av de adenovirale genene E1 (ansvarlig for montering av smittsomme viruspartikler) og E3 (koding av proteiner involvert i unnvikelse av vertsimmunitet) skapte et rom i det adenovirale genomet, der et gen av interesse på 6,5-7,5 kb kan settes inn2,3. Denne størrelsen er tilstrekkelig for mange gener, spesielt for de med kortere introns15,16,17. Det er også forskere som rapporterer produksjon av adenovirus som bærer cDNA av en transgene18,19,20. Vi fikk imidlertid et lavere utbytte av transgene uttrykk for cDNA-bærende adenovirus enn for deres kolleger som bærer et gen eller et minigen (data ikke vist).
Forbedre og tilpasse de forrige metodene2,10,14,18,21, krever teknologien for adenoviral produksjon kortere tid, lavere kostnader og mindre innsats. Det adenovirale DNA-et i full lengde oppnås ved rekombinasjon mellom skyttelvektoren og pAdEasy-1-plasmiden i den homologe rekombinasjonsutsatte E. coli-stammen, BJ5183. Protokollen innebærer kjemisk transformasjon av AdEasier-1 celler (BJ5183 bakterier som inneholder pAdEasy-1). Denne teknikken krever ikke en elektroporator som kanskje ikke er tilgjengelig i noen laboratorier, er veldig enkel, øker rekombinasjonsutbyttet og reduserer tiden som er nødvendig for å oppnå kompetente celler og for å utføre transformasjonen. Forhåndsvalget av rekombinante kloner utført av PCR forkorter tiden ytterligere og letter hele prosedyren. En lignende prosedyre ble brukt av Zhao og medarbeidere22, men i protokollen optimaliserte vi sekvensene til primerne.
For GFP-adenovirusemballasje og forsterkning ble det brukt en HEK293 derivatcellelinje, nemlig AD293-celler, som er mer tilhenger av kulturplaten. Andre cellelinjer som vanligvis brukes til adenoviral produksjon er følgende: 911, 293FT, pTG6559 (A549 derivat), PER. C6 (HER derivat), GH329 (HeLa derivat), N52. E6 og HeLa-E123,24,25,26. I våre hender ble det ikke oppnådd noen forbedring i adenoviralproduksjonen da 911 celler ble brukt (data ikke vist). Transfeksjonen av AD293-celler med rekombinant plasmid ved hjelp av K2-reagens økte effektiviteten til viral emballasjetrinnet sterkt. Etter adenovirusproduksjon er opptil ~ 70% av adenoviruset fortsatt inne i cellene og frigjøres ved tre fryse- og opptiningssykluser. Å øke antall sykluser er ikke egnet fordi det ødelegger adenoviruset.
Gjennom hele den rutinemessige adenovirale produksjonsprosessen frigjøres mange virale partikler i cellekulturmediet. Å kaste bort dette cellekulturmediet under høsting av de infiserte AD293-cellene vil resultere i et viktig virustap. Vi optimaliserte protokollen beskrevet av Schagen og medarbeidere for å rense adenoviralpartiklene fra cellekulturmediet ved nedbør med ammoniumsulfat27. Denne metoden har en høyere effektivitet i adenovirusgjenoppretting fra cellekulturmediet sammenlignet med metoden ved hjelp av polyetylenglykol28. Det utfelte adenoviruset skal renses umiddelbart ved ultracentrifugation eller holdes i kjøleskapet i et par dager, men bare etter dialyse, for å fjerne saltoverskuddet. Å holde utfellingen lenger enn noen få timer uten dialyse er skadelig for viruset.
Rensing av adenoviralpartiklene ved ultracentrifugation utført i ett trinn reduserer manipuleringen av adenoviralbestanden og letter prosedyren sammenlignet med protokollene ved hjelp av påfølgende ultracentrifugation trinn14,29. Dialyse av renset adenovirus er nødvendig for å fjerne cesiumklorid som kan påvirke transduksjonen ytterligere. I protokollen brukte vi Tris buffer som inneholder MgCl2, men ikke sukrose for dialyse, siden det krever en stor, uberettiget mengde sukrose som ellers er nødvendig som konserveringsmiddel for frysing. Dermed la vi til sukrose senere, direkte inn i de adenovirale bestandene forberedt på frysing. For å unngå hyppig frysing og opptining av det rensede adenoviruset, anbefales det å aliquot adenovirallagrene og lagre dem ved -80 °C. Den adenovirale titeren ble evaluert av strømningscytometri med tanke på GFP-reportergenet og prosentandelen transinduserte celler for en bestemt viral fortynning. Denne metoden er raskere sammenlignet med den klassiske “plakkanalysen” og er mer pålitelig sammenlignet med evalueringen av kapsidproteinene (ved ulike metoder som ELISA eller strømningscytometri) som ikke avslører kapasiteten til infeksjon av de adenovirale partiklene. Elisa-basert kvantifisering, Q-PCR eller plakkanalyse ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett er imidlertid alternative metoder, spesielt nyttige for titrering av adenovirus som ikke inneholder en fluorescerende tracer.
Tatt i betraktning at pAdTrack adenovirus er avledet fra humane adenovirus serotype 5 som er anerkjent av Coxsackievirus og Adenovirus reseptorer (CAR), demonstrerte vi kapasiteten til GFP-adenoviruset til å transdusere celler av menneskelig opprinnelse (endotelceller), men også celler av andre opprinnelser: bovine (endotelceller) og murine (mesenchymale stromale celler og hepatocy). Dataene viste at GFP-adenoviruset kan indusere et høyt uttrykk for en transgene.
Til slutt optimaliserte vi denne arbeidskrevende teknologien for å redusere tiden, kostnadene og innsatsen som trengs for å oppnå de adenovirale partiklene. Adenoviruset som er tilberedt er i stand til å infisere ulike celletyper og å indusere uttrykket av genet av interesse. Denne protokollen kan brukes i en rekke eksperimenter siden den adenoviralmedierte genoverføringen representerer et av hovedverktøyene for å utvikle moderne genterapier.
FORKORTELSER: AdV-GFP, adenovirale partikler; BAEC, bovine aorta endotelceller; CsCl, cesiumklorid; GFP, grønt fluorescerende protein; MSC, mesenchymale stromale celler; TU, transduseringsenheter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et prosjekt finansiert fra Det europeiske regionale utviklingsfondet gjennom Competitiveness Operational Program 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; akronym DIABETER), et tilskudd fra det rumenske forsknings- og innovasjonsdepartementet PCCDI- UEFISCDI, prosjektnummer PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 innen PNCD III og av det rumenske akademiet. Forfatterne takker Kyriakos Kypreos (Universitetet i Patras, Hellas) for hans generøse og relevante råd, Ovidiu Croitoru (University of Fine Arts, Bucuresti, Romania) for filming, filmredigering og grafisk design, og Mihaela Bratu for teknisk assistanse.
AD293 cells | Agilent Technologies | 240085 | |
AdEasier-1 cells | Addgene | 16399 | |
Agarose I (for electrophoresis) | Thermo Scientific | 17850 | |
Ammonium sulfate | Sigma | A4418 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma | A0166 | |
BamH I | Thermo Scientific | FD0054 | |
Cell culture plates 100 mm | Eppendorf | 30702115 | |
Cesium chloride | Sigma | L4036 | |
DH5alpha bacteria | Thermo Scientific | 18265017 | |
DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose) | Gibco | 3240-027 | |
EA.hy926 cells | ATCC | CRL-2922 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethanol (99.8%) | Roth | 5054.2 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524 | |
Flasks T25, T75, T175 | Eppendorf | 30712129 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Hepa 1-6 murine hepatocytes | ATCC | CRL-1830 | |
Hind III | Thermo Scientific | FD0504 | |
Kanamycin Sulfate | Thermo Scientific | 15160054 | |
K2 Transfection System | Biontex | T060-5.0 | |
LB medium | Formedium | LBx0102 | |
LB-agar | Formedium | LBx0202 | |
Mix & Go E. coli Transformation kit | Zymo Research | T3001 | |
Midori Green Advanced DNA stain | Nippon Genetics Europe | MG-04 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Opti-MEM | Thermo Scientific | 31985070 | |
Pac I | Thermo Scientific | FD2204 | |
pAdEasy-1 | Addgene | 16400 | |
pAdTrack-CMV | Addgene | 16405 | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1) | Invitrogen | 15593-031 | |
Polymerase GoTaq | Promega | M3005 | |
Pme I (Mss I) | Thermo Scientific | FD1344 | |
Potassium acetate | VWR Chemicals | 43065P | |
Pst I | Thermo Scientific | FD0614 | |
Qiagen Midi Prep kit | Qiagen | 12125 | |
Cell Scraper | TPP | 99003 | |
SDS | Thermo Scientific | 28365 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66330 | |
Sodium pyruvate | SIGMA | P5280-100G | |
Syringe with 23G neeedle | B Braun | 464BR | |
Tris HCl | Sigma | 1185-53-1 | |
Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
Tubes 50ml | TPP | 91050 | |
Ultra-Clear Tubes (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
Centrifuge (refrigerated) | Sigma Sartorius | 3-19KS | |
HeraeusFresco 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | |
Ultracentrifuge with SW41Ti rotor | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | |
Culture Hood | Thermo Scientific | Class II | |
Pipettes (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl) | Thermo Scientific | ||
Dry Block Heating Thermostat | Biosan | TDB-120 | |
Thermocycle | SensoQuest | 012-103 | |
Water Bath | Memmert | WNB 14 |