Triagem In Vivo CRISPR/Cas9 para avaliar simultaneamente a função genética na pele do rato e na cavidade oral
Summary
Aqui descrevemos uma metodologia rápida e direta de triagem in vivo CRISPR/Cas9 utilizando ultrassom guiado em injeções lentiviras embrionárias uterobrionárias para avaliar simultaneamente funções de vários genes na pele e cavidade oral de camundongos imunocompetrente.
Abstract
Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMM) têm sido fundamentais na avaliação da função genética, modelagem de doenças humanas e servindo como modelo pré-clínico para avaliar caminhos terapêuticos. No entanto, sua natureza de tempo, trabalho e custo-intensivo limita sua utilidade para análise sistemática da função genética. Os recentes avanços nas tecnologias de edição de genomas superam essas limitações e permitem a rápida geração de perturbações genéticas específicas diretamente dentro de órgãos específicos do mouse de forma multiplexada e rápida. Aqui, descrevemos um método baseado em CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para gerar milhares de clones de knock-out genéticos dentro do epitélio da pele e cavidade oral dos camundongos, e fornecer um protocolo detalhando os passos necessários para realizar uma tela CRISPR direta para genes supressores tumorais. Essa abordagem pode ser aplicada a outros órgãos ou outras tecnologias CRISPR/Cas9, como a ativação crispr ou a inativação crispr para estudar a função biológica dos genes durante a homeostase tecidual ou em vários ambientes de doenças.
Introduction
Um dos desafios para a pesquisa do câncer na era pós-genômica é minerar a vasta quantidade de dados de genoma para mutações genéticas causais e identificar nós na rede genética que podem ser direcionados terapeuticamente. Embora as análises bioinformáticas tenham ajudado imensamente nesse sentido, estabelecer modelos in vitro e in vivo eficientes é um pré-requisito para decifrar a complexidade dos sistemas biológicos e estados de doenças e para permitir o desenvolvimento de medicamentos. Embora os modelos convencionais de camundongos transgênicos tenham sido usados extensivamente para estudos de genética do câncer in vivo, sua natureza de custo, tempo e trabalho intensivo proibiu em grande parte a análise sistemática das centenas de genes putativos de câncer desvendados pela genômica moderna. Para superar esse gargalo, combinamos uma tecnologia de edição de genes previamente estabelecida no ultrassom na metodologia de injeção do útero1,2 com uma tecnologia de edição de genes CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)para induzir e estudar simultaneamente mutações de perda de função de centenas de genes na pele e cavidade oral de um único rato.
A metodologia descrita aqui utiliza injeções guiadas por ultrassom de lentivírus projetados na cavidade amniótica de embriões de camundongos vivos no dia embrionário E9.5. A carga lentiviral contendo componentes CRISPR/Cas9 transduzir o ectoderme de superfície em camada única, que mais tarde dá origem ao epitélio da pele e da cavidade oral. A pele é composta de uma epiderme externa, seguida por membrana do porão e derme. Epiderme é um epitélio estratificado composto por uma camada interna basal, que mantém contato com a membrana do porão e tem capacidade proliferativa e de células-tronco. A camada basal dá origem às camadas diferenciadas acima, como camadas de córneas espinhosas, granulares eestratosas 2,4. Estudos de rastreamento de linhagem mostram que este método in vivo CRISPR/Cas9 manipula geneticamente células-tronco residentes em tecidos dentro da camada basal que persistem durante toda a idade adulta. Como o lentivírus pode ser titulado para transduturar o ectoderm superficial E9.5 na densidade clonal, este método pode ser usado para gerar ratos de mosaico abrigando milhares de clones de knock-out genéticos discretos. O sequenciamento da próxima geração pode então ser usado para analisar o efeito da ablação genética mediada pelo CRISPR/Cas9 dentro desses clones de forma multiplexada5.
Recentemente, utilizamos este método para avaliar a função de 484 genes que mostram mutações recorrentes no Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço Humano (HNSCC)5. O HNSCC é um câncer devastador com uma alta taxa de mortalidade de 40 a 50% e é o6º câncer mais comum em todo o mundo6. O HNSCC surge em forros mucosas das vias aéreas superiores ou da cavidade oral e está associado ao consumo de tabaco e álcool ou infecção por papilomavírus humano (HPV). Carcinoma de Células Escamosas Cutâneas (CCS) são tumores de pele e representam o segundo câncer mais comum em humanos7. O CCS cutâneo e o HNSCC são histologicamente e molecularmente muito semelhantes, com um alto percentual de casos apresentando alteração em TP53, PIK3CA, NOTCH1 e HRAS8. Embora haja apenas um punhado de genes mutados em alta frequência, há centenas de genes encontrados mutados em baixa frequência (< 5%), um fenômeno comumente referido como a distribuição de cauda longa. Como a maioria dos genes de cauda longa não tem validação biológica ou clínica, usamos esta tecnologia de triagem in vivo CRISPR para modelar a perda de função desses genes em camundongos propensos a tumores com mutações sensibilizantes em p53, Pik3ca ou Hras e identificamos vários novos genes supressores de tumores que cooperam com p53, Pikca ou Hras para desencadear o desenvolvimento do tumor5.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para gerar bibliotecas sgRNA lentiviral sgRNA multiplexed sgRNA e executar telas de knock-out de genes CRISPR/Cas9 no ectoderme da superfície do mouse. Note-se que essa metodologia pode ser adaptada para incorporar outras tecnologias de manipulação genética, como a ativação crispr (CRISPRa) e a inativação CRISPR (CRISPRi) ou modificada para atingir outros sistemas de órgãos no mouse para estudar funções genéticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A edição do genoma CRISPR/Cas9 tem sido amplamente utilizada em estudos in vitro e in vivo para investigar funções genéticas e processos celulares. A maioria dos estudos in vivo utiliza células editadas por genes CRISPR/Cas9 enxertadas em um modelo animal (aoenxerto ou xenoenxerto). Embora esta seja uma ferramenta poderosa para estudar a genética do câncer e funções celulares, ela ainda carece do microambiente do tecido nativo e pode provocar ferimentos e/ou respostas imunológicas.
…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR 365252), da Fundação Krembil e do Ontario Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan é o beneficiário de uma bolsa da Canadian Cancer Society (BC-F-16#31919).
Materials
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
Referências
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