Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.
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Artigo de método
Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Obesidade e distúrbios metabólicos, como diabetes, doenças cardíacas e câncer, estão todos associados à dramática remodelação do tecido adiposo. As células progenitoras adiposas residentes em tecido (APCs) desempenham um papel fundamental na homeostase tecidual e podem contribuir para a patologia do tecido. O uso crescente de tecnologias de análise celular única – incluindo sequenciamento de RNA unicelular e proteômica unicelular – está transformando o campo de células-tronco/progenitora, permitindo uma resolução sem precedentes de mudanças individuais de expressão celular no contexto de mudanças populacionais ou teciduais. Neste artigo, fornecemos protocolos detalhados para dissecar tecido adiposo epidímico do camundongo, isolar células derivadas de tecido adiposo único e realizar a triagem celular ativada de fluorescência (FACS) para enriquecer para Sca1+/CD31 viável-/CD45-/Ter119- APCs. Esses protocolos permitirão que os pesquisadores preparem APCs de alta qualidade adequados para análises a jusante, como sequenciamento de RNA de célula única.
Introdução
O tecido adiposo desempenha um papel fundamental no metabolismo energético. O excesso de energia é armazenado na forma de lipídios, e o tecido adiposo é capaz de expansão ou retração significativa, dependendo do estado nutricional e da demanda energética. A expansão do tecido adiposo pode resultar de um aumento no tamanho do adipócito (hipertrofia) e/ou de um aumento no número de adipócitos (hiperplasia); este último processo fortemente regulado pela proliferação e diferenciação das células progenitorasadiposas 1,2. Durante a obesidade, o tecido adiposo se expande excessivamente, e a disfunção tecidual – inclu....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados sob aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Clínica Mayo.
1. Preparação da solução
- Prepare a solução de colagenase 2% (w/v) dissolvendo a colagemnase II 2 g na solução de sal balanceada (HBSS) de 100 mL da Hanks. Alíquota de 200 μL cada para cada uso.
- Prepare o meio de neutralização misturando 84 mL F-12 médio, 15 mL de serum de cavalo e penicilina/estreptomicina de 1 mL.
- Prepare o tampão de citometria de fluxo dissolvendo 500 mg de albumina de soro bovino (BSA) e 400 μL de 0,5 M EDTA em 100 mL da linha ....
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Resultados
Camundongos FVB machos de quatro meses de idade foram usados neste experimento. Após a exclusão de detritos e dobras utilizando lotes FSC/SSC, células viáveis (DAPI- população) foram fechadas, seguidas pela seleção de APC+/FITC- população (Figura 1). Os portões DAPI, APC e FITC foram desenhados com base no controle não manchado. As estratégias de gating são mostradas na Figura 1.
Após 1h de triagem, a .......
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Discussão
O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) está rapidamente ganhando tração como uma ferramenta poderosa para estudar simultaneamente diversas populações celulares no nível único celular. Devido aos altos custos associados à preparação da amostra e ao sequenciamento de alto rendimento, é imperativo otimizar as entradas celulares (alta viabilidade e pureza) para aumentar a probabilidade de sucesso experimental. Alguns protocolos de preparação celular dependem da remoção de células mortas e detritos usando lavagen.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Reconhecemos a Instalação de Citometria do Núcleo de Análise celular da Clínica Mayo clinic para assistência com a triagem FACS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tubo de cultura de 13 mL | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| Tubo cônico de 15 mL | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| Tubo de ensaio de 5 mL com tampa de pressão do filtro de células | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Tubo cônico de 50 mL | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µ filtro de células m | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC anticorpo | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC anticorpo | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC anticorpo | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC anticorpo | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Colagenase tipo II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| Reagente bloqueador FcR | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Solução salina balanceada de Hanks (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Soro de cavalo | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Solução de iodeto de propídio | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
Referências
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A.
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Reimpressões e permissões
