في المختبر تقييم التحول Oncogenic في الخلايا الظهارية ماماري الإنسان
Summary
يوفر هذا البروتوكول أدوات تجريبية في المختبر لتقييم تحول الخلايا الثديية البشرية. ويرد وصف الخطوات التفصيلية لمتابعة معدل انتشار الخلايا، والقدرة على النمو المستقلة للرسو، وتوزيع أنساب الخلايا في الثقافات ثلاثية الأبعاد مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
Abstract
ورم نيجنيسيس هو عملية متعددة الخطوات التي الخلايا اكتساب القدرات التي تسمح نموها, البقاء على قيد الحياة, ونشرها في ظل ظروف عدائية. وتسعى الاختبارات المختلفة إلى تحديد هذه السمات المميزة للخلايا السرطانية وتحديدها كمياً؛ ومع ذلك، فإنها غالباً ما تركز على جانب واحد من التحول الخلوي، وفي الواقع، هناك حاجة إلى اختبارات متعددة لتوصيفها الصحيح. والغرض من هذا العمل هو تزويد الباحثين بمجموعة من الأدوات لتقييم التحول الخلوي في المختبر من منظور واسع، مما يجعل من الممكن استخلاص استنتاجات سليمة.
إن تنشيط الإشارات التكاثرية المستمرة هو السمة الرئيسية للأنسجة السرطانية ويمكن مراقبته بسهولة في ظروف في المختبر عن طريق حساب عدد مضاعفة السكان التي تحققت مع مرور الوقت. الى جانب ذلك ، فإن نمو الخلايا في الثقافات 3D يسمح تفاعلها مع الخلايا المحيطة بها ، تشبه ما يحدث في الجسم الحي. وهذا يمكّن من تقييم التجميع الخلوي، و، جنبا إلى جنب مع وضع العلامات المناعية من علامات الخلوية المميزة، للحصول على معلومات عن سمة أخرى ذات صلة من التحول الورمي: فقدان التنظيم السليم. سمة أخرى ملحوظة من الخلايا المحولة هي قدرتها على النمو دون التعلق بالخلايا الأخرى وإلى المصفوفة خارج الخلية ، والتي يمكن تقييمها مع مقايسة المرسى.
يتم توفير إجراءات تجريبية مفصلة لتقييم معدل نمو الخلايا ، لأداء وضع العلامات المناعية لعلامات نسب الخلايا في الثقافات ثلاثية الأبعاد ، واختبار نمو الخلايا المستقلة للرسو في الأجار الناعم. هذه المنهجيات هي الأمثل لثدى الثدي الأولية الخلايا الظهارية (BPEC) نظرا لصلتها بسرطان الثدي; ومع ذلك، يمكن تطبيق الإجراءات على أنواع الخلايا الأخرى بعد بعض التعديلات.
Introduction
وهناك حاجة إلى أحداث متتالية متعددة لتطوير الأورام. في عام 2011، وصف هاناهان ووانبرغ 10 قدرات تمكن نمو الخلايا المتحولة، والبقاء على قيد الحياة، والنشر: ما يسمى “السمات المميزة للسرطان”1. المنهجية الموصوفة هنا تجمع ثلاث أدوات مختلفة لتقييم التحول الخلوي في المختبر من خلال التركيز على بعض السمات المميزة للخلايا السرطانية. هذه التقنيات تقييم معدل انتشار الخلايا، وسلوك الخلايا عندما مثقف في 3D وقدرتها على تشكيل المستعمرات مع استقلال الرسو.
نماذج الخلايا حاسمة لاختبار الفرضية في المختبر. وقد تم تطوير مناهج مختلفة لتوليد نماذج تجريبية للتحول الخلوي لدراسة السرطان2،3،4. منذ سرطان الثدي هو السرطان الأكثر شيوعا بين النساء في جميع أنحاء العالم، وهو المسؤول عن ما يقرب من 15٪ من وفيات السرطان بين النساء5،وتوفير نماذج الخلوية المناسبة من الخلايا الظهارية ماماري هو في غاية الأهمية لمزيد من التحقيق. في هذه المقالة، وقد أوضحنا إمكانات ثلاث تقنيات لتقييم التحول الخلوي باستخدام نموذج تجريبي من الثدي الأولية الخلايا الظهارية (BPECs) التحول في البداية وصفها إينس وزملاؤه في 20076 وتنفيذها في وقت لاحق في مختبرنا7. ويستند هذا النموذج التجريبي على التغيير التسلسلي من ثلاثة جينات مستهدفة (SV40 T كبيرة وt مستضدات صغيرة يشار إليها هنا باسم Ttag، hTERT، و HRAS) إلى الجينوم من BPECs غير محولة. وعلاوة على ذلك، فإن الطريقة المستخدمة لاشتقاق BPECs تفضل الحفاظ على الخلايا الظهارية الثديية مع علامات اللمعان أو ميوفيتيل، مما يؤدي إلى ثقافة الخلايا غير المتجانسة التي تحتفظ ببعض الصفات الفسيولوجية للغدة الثديية.
في الغدة الثديية، تقع الخلايا الظهارية المامية الإنارةية، المسؤولة عن إنتاج الحليب، بالقرب من التجويف، في حين يتم التخلص من الخلايا العضلية حول الخلايا الإنارة ورعاية حركات الانكماش التي تؤدي الحليب إلى الحلمة. فقدان التنظيم السليم بين هذه النسب الخلية هو سمة من سمات التحول الورمي8 التي يمكن تقييمها في المختبر بعد الكشف المناعي من علامات النسب المميزة في ثقافات الخلايا 3D. ومن الخصائص الرئيسية الأخرى للخلايا السرطانية قدرتها على النمو دون التعلق بالخلايا الأخرى وإلى المصفوفة1خارج الخلية. عندما يتم إجبار الخلايا السليمة على النمو في التعليق، آليات مثل anoikis \u2012 نوع من موت الخلية الناجمة عن استجابة فصيلة من مصفوفة خارج الخلية \u2012 يتم تنشيط9. التهرب من موت الخلايا هي واحدة من السمات المميزة للسرطان، وبالتالي، الخلايا المحولة قادرة على تعطيل anoikis والبقاء على قيد الحياة بطريقة مستقلة عن المرساة. ويمكن تقييم هذه القدرة في المختبر مع المقايسة المستقلة المرسى باستخدام agar لينة. وعلاوة على ذلك، فإن السمة المتأصلة في الأنسجة السرطانية هي قدرتها على الإشارات التكاثرية المستمرة، والتي يمكن رصدها بسهولة في ظروف المختبر عن طريق قياس زيادة عدد الخلايا على طول الوقت، ليس فقط في المقايسات التعليق ولكن أيضا عن طريق رصد معدل نمو الثقافات ذات الطبقات الأحادية.
على الرغم من أن أفضل نموذج لاختبار الإمكانات الأورام هو تلقيح الخلايا السرطانية في نماذج مورين وتقييم تطور الورم في الموقع ، فمن المهم تقليل عدد الحيوانات المستخدمة في الإجراءات التجريبية قدر الإمكان. ولذلك، وجود اختبارات مناسبة لتقييم التحول في المختبر هو أولوية قصوى. هنا، نحن نقدم مجموعة من الأدوات لتقييم الإمكانات الأورام من خلايا الثدي الظهارية جزئياً أو كلياً التي يمكن تنفيذها بسهولة في معظم المختبرات التي تعمل مع نماذج التحول الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
10- وتوفر البروتوكولات التجريبية الموصوفة في هذه الورقة أدوات مفيدة لتقييم التحول المُعدي للخلايا المُزَوَّقة في المختبر. كل تقنية تقيم جوانب محددة من عملية التحول، وبالتالي، يجب إيلاء اهتمام خاص عند استخلاص استنتاجات من تحليل واحد. النمو منحنيات بناء هو النهج الذي يتطلب المعلومات المتا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويمول مختبر AG المجلس الإسباني للسلامة النووية. ت.أ. و أ. ج. عضوان في مجموعة بحثية معترف بها من قبل جنرالات كاتالونيا (2017-SGR-503). تحمل شركة MT عقدًا ممولًا من المؤسسة العلمية Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. يتم تمويل عقد G.F. من منحة من مؤسسة سيليكس.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
- Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71 (2008).
- Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422 (2017).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
- Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112 (2015).
- Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65 (2018).
