In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen
Summary
Dieses Protokoll bietet experimentelle In-vitro-Werkzeuge zur Bewertung der Transformation menschlicher Brustzellen. Detaillierte Schritte zur Nachverfolgung der Zellproliferationsrate, der verankerungsunabhängigen Wachstumskapazität und der Verteilung von Zelllinien in 3D-Kulturen mit Kellermembranmatrix werden beschrieben.
Abstract
Tumorigenese ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem Zellen Fähigkeiten erwerben, die ihr Wachstum, überleben und verbreiten unter feindlichen Bedingungen ermöglichen. Verschiedene Tests zielen darauf ab, diese Merkmale von Krebszellen zu identifizieren und zu quantifizieren; Sie konzentrieren sich jedoch häufig auf einen einzigen Aspekt der zellulären Transformation, und tatsächlich sind mehrere Tests für ihre korrekte Charakterisierung erforderlich. Ziel dieser Arbeit ist es, Forschern eine Reihe von Instrumenten zur Verfügung zu stellen, um die zelluläre Transformation in vitro aus einer breiten Perspektive zu bewerten und so fundierte Schlussfolgerungen zu ziehen.
Eine nachhaltige proliferative Signalaktivierung ist das Hauptmerkmal von Tumorgeweben und kann leicht unter In-vitro-Bedingungen überwacht werden, indem die Anzahl der im Laufe der Zeit erreichten Bevölkerungsverdoppelungen berechnet wird. Außerdem ermöglicht das Wachstum von Zellen in 3D-Kulturen ihre Interaktion mit umgebenden Zellen, ähnlich dem, was in vivo vorkommt. Dies ermöglicht die Bewertung der zellulären Aggregation und zusammen mit der immunfluoreszenzenten Kennzeichnung von ausgeprägten zellulären Markern, Um Informationen über ein weiteres relevantes Merkmal der Tumortransformation zu erhalten: den Verlust der richtigen Organisation. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal transformierter Zellen ist ihre Fähigkeit, ohne Bindung an andere Zellen und an die extrazelluläre Matrix zu wachsen, die mit dem Anker-Assay ausgewertet werden kann.
Detaillierte experimentelle Verfahren zur Bewertung der Zellwachstumsrate, zur immunfluoreszenzenten Kennzeichnung von Zelllinienmarkern in 3D-Kulturen und zur Erprobung des verankerungsunabhängigen Zellwachstums in weichem Agar werden bereitgestellt. Diese Methoden sind für primäre Epithelzellen (BPEC) der Brust aufgrund ihrer Relevanz bei Brustkrebs optimiert; Nach einigen Anpassungen können jedoch Prozeduren auf andere Zelltypen angewendet werden.
Introduction
Für die Entwicklung von Neoplasma sind mehrere aufeinanderfolgende Ereignisse erforderlich. Im Jahr 2011 beschrieben Hanahan und Weinberg 10 Fähigkeiten, die das Wachstum, überleben und die Verbreitung transformierter Zellen ermöglichen: die sogenannten “Hallmarks of Cancer”1. Die hier beschriebene Methodik stellt drei verschiedene Werkzeuge zur Bewertung der in vitro zellulären Transformation zusammen, indem sie sich auf einige der Besonderheiten der Tumorzellen konzentriert. Diese Techniken bewerten die Zellproliferationsrate, das Verhalten von Zellen, wenn sie in 3D kultiviert werden, und ihre Fähigkeit, Kolonien mit Ankerunabhängigkeit zu bilden.
Zellmodelle sind entscheidend, um Hypothesen in vitro zu testen. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um experimentelle Modelle der zellulären Transformation für die Untersuchung von Krebs zu generieren2,3,4. Da Brustkrebs weltweit die häufigste Krebsart bei Frauen ist und für etwa 15 % der Krebstoten bei Frauen5verantwortlich ist, ist die Bereitstellung geeigneter Zellmodelle von Brustepithelzellen von größter Bedeutung für die weitere Untersuchung. In diesem Artikel haben wir das Potenzial von drei Techniken zur Bewertung der zellulären Transformation anhand eines experimentellen Modells der Transformation von Breast Primary Epithelial Cells (BPECs) veranschaulicht, die ursprünglich von Ince und Kollegen im Jahr 20076 beschrieben und später in unserem Labor implementiert wurden7. Dieses experimentelle Modell basiert auf der sequenziellen Veränderung von drei gezielten Genen (SV40 Large T und small t Antigene hierin, die als Ttag, hTERTund HRASbezeichnet werden) in das Genom von nicht transformierten BPECs. Darüber hinaus begünstigt die Methode, die für die Ableitung von BPECs verwendet wird, die Aufrechterhaltung von Brustepithelzellen mit luminalen oder myoepithelialen Markern, was zu einer heterogenen Zellkultur führt, die einige der physiologischen Merkmale der Brustdrüse beibehält.
In der Brustdrüse befinden sich luminale Brustepithelzellen, die für die Milchproduktion verantwortlich sind, in der Nähe des Lumens, während Myoepithelzellen um Leuchtkörperzellen angeordnet sind und sich um Kontraktionsbewegungen kümmern, die die Milch zur Brustwarze führen. Der Verlust der richtigen Organisation zwischen diesen Zelllinien ist ein Merkmal der tumoralen Transformation8, das in vitro nach immunfluoreszierendem Nachweis von markanten Linienmarkern in 3D-Zellkulturen beurteilt werden kann. Ein weiteres wesentliches Merkmal von Tumorzellen ist ihre Fähigkeit, ohne Bindung an andere Zellen und an die extrazelluläre Matrix1zu wachsen. Wenn gesunde Zellen gezwungen werden, in Suspension zu wachsen, werden Mechanismen wie anoikis – u2012 eine Art von Zelltod induziert als Reaktion auf die Ablösung von der extrazellulären Matrix aktiviert. Die Umgehung des Zelltodes ist eines der kennzeichens Merkmale von Krebs und somit sind transformierte Zellen in der Lage, Anoikis zu inaktivieren und ankerunabhängig zu überleben. Diese Kapazität kann in vitro mit dem anchorage-unabhängigen Assay mit weichem Agar ausgewertet werden. Darüber hinaus ist ein inhärentes Merkmal von Tumorgeweben ihre anhaltende proliferative Signalfähigkeit, die leicht unter In-vitro-Bedingungen überwacht werden kann, indem der Anstieg der Zellzahl entlang der Zeit gemessen wird, nicht nur in Suspensionstests, sondern auch durch die Überwachung der Wachstumsrate von monolayer-anhaftenden Kulturen.
Trotz des besten Modells, um tumorigenic Potenzial zu testen ist die Impfung von Tumorzellen in murinen Modellen und Bewertung der Tumorentwicklung in situ, ist es wichtig, die Anzahl der Tiere in experimentellen Verfahren so weit wie möglich verwendet zu minimieren. Daher hat die Bewertung der Transformation in vitro geeignete Tests oberste Priorität. Hier stellen wir eine Reihe von Werkzeugen zur Verfügung, um das tumorgene Potenzial von teilweise und vollständig transformierten Brustepithelzellen zu bewerten, die leicht in den meisten Laboratorien implementiert werden können, die mit zellulären Transformationsmodellen arbeiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Papier beschriebenen experimentellen Protokolle bieten nützliche Instrumente zur Bewertung der onkogenen Transformation von In-vitro-kulturierten Zellen. Jede Technik bewertet bestimmte Aspekte des Transformationsprozesses, und daher muss bei der Schlussfolgerungausarbeit aus einer einzigen Analyse besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. Wachstumskurven-Aufbau ist ein Ansatz, der Informationen erfordert, die bereits verfügbar sind, wenn Zellen für andere Zwecke kultiviert werden. Das macht diese Techn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Labor der AG wird vom spanischen Rat für nukleare Sicherheit finanziert. T.A. und A.G. sind Mitglieder einer von der Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503) anerkannten Forschungsgruppe. MT hat einen Vertrag, der von der Wissenschaftlichen Stiftung Asociacion Espaéola Contra el Céncer [AECC-INVES19022TERR] finanziert wird. Der G.F.-Vertrag wird durch einen Zuschuss der Cellex Foundation finanziert.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
Referências
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