הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים
Summary
פרוטוקול זה מספק כלים ניסיוניים במבחנה כדי להעריך את הטרנספורמציה של תאי אם אנושיים. מתוארים שלבים מפורטים לקצב התפשטות תאים, יכולת צמיחה בלתי תלויה בעיגון והפצה של שושלת תאים בתרבויות תלת-מימד עם מטריצת קרום מרתף.
Abstract
Tumorigenesis הוא תהליך רב שלבי שבו תאים לרכוש יכולות המאפשרות הצמיחה שלהם, הישרדות, והפצה בתנאים עוינים. בדיקות שונות מבקשות לזהות ולכרות סימני היכר אלה של תאים סרטניים; עם זאת, לעתים קרובות הם מתמקדים בהיבט אחד של טרנספורמציה תאית, ולמעשה, בדיקות מרובות נדרשות לאפיון הנכון שלהם. מטרת עבודה זו היא לספק לחוקרים סט של כלים להערכת טרנספורמציה תאית במבחנה מנקודת מבט רחבה, ובכך לאפשר להסיק מסקנות קול.
הפעלת איתות מתמשך היא התכונה העיקרית של רקמות הגידול והוא יכול להיות במעקב בקלות תחת תנאים במבחנה על ידי חישוב מספר הכפלות האוכלוסייה שהושגו לאורך זמן. חוץ מזה, הצמיחה של תאים בתרבויות 3D מאפשר האינטראקציה שלהם עם התאים שמסביב, דומה למה שקורה vivo. זה מאפשר הערכה של צבירת תאים, יחד עם תיוג immunofluorescent של סמנים תאיים ייחודיים, כדי לקבל מידע על תכונה רלוונטית אחרת של טרנספורמציה גידולית: אובדן ארגון תקין. מאפיין יוצא דופן נוסף של תאים שהשתנו הוא יכולתם לגדול ללא חיבור לתאים אחרים ולמטריצה החוץ-תאית, אותה ניתן להעריך באמצעות מבחני המעגן.
נהלים ניסיוניים מפורטים להערכת קצב צמיחת התאים, לביצוע תיוג immunofluorescent של סמני שושלת תאים בתרבויות 3D, ולבדוק צמיחת תאים עצמאית מעגן אגר רך מסופקים. מתודולוגיות אלה ממוטבות לתאי אפיתל ראשוניים בשד (BPEC) בשל הרלוונטיות שלה בסרטן השד; עם זאת, ניתן להחיל שגרות על סוגי תאים אחרים לאחר התאמות מסוימות.
Introduction
אירועים רצופים מרובים נדרשים לפיתוח neoplasm. בשנת 2011, חנהאן ויינברג תיארו 10 יכולות המאפשרות צמיחה, הישרדות והפצה של תאים שהשתנו: מה שמכונה “סימני ההיכר של הסרטן”1. המתודולוגיה המתוארת כאן אוספת שלושה כלים שונים להערכת טרנספורמציה תאית במבחנה על ידי התמקדות בכמה מהתכונות הייחודיות של התאים הגידוליים. טכניקות אלה מעריכות את שיעור התפשטות התאים, את התנהגות התאים כאשר הם מתורבתים תלת-מימד ואת יכולתם ליצור מושבות עם עצמאות מעגן.
מודלים של תאים חיוניים לבדיקת השערה במבחנה. גישות שונות פותחו כדי ליצור מודלים ניסיוניים של טרנספורמציה תאית לחקרהסרטן 2,3,4. מאז סרטן השד הוא הסרטן השכיק ביותר בקרב נשים ברחבי העולם והוא אחראי על כ 15% ממקרי המוותמסרטן בקרב נשים 5, מתן מודלים תאיים מתאימים של תאי אפיתל חלבי הוא בעל חשיבות עליונה להמשך חקירה. במאמר זה, ימחצנו את הפוטנציאל של שלוש טכניקות כדי להעריך טרנספורמציה תאית באמצעות מודל ניסיוני של תאים אפיתל ראשי השד (BPECs) טרנספורמציה שתוארה בתחילה על ידי Ince ועמיתיו בשנת 20076 ומאוחר יותר מיושםבמעבדה שלנו 7. מודל ניסיוני זה מבוסס על שינוי רציף של שלושה גנים ממוקדים (SV40 גדול T ואנטיגנים t קטנים המכונה Ttag, hTERT, ו HRAS) לגנום של BPECs שאינם טרנספורמציה. יתר על כן, השיטה המשמשת נגזרת BPECs מעדיף את התחזוקה של תאי אפיתל החלב עם סמנים זוהרים או myoepithelial, וכתוצאה מכך תרבות תאים הטרוגניים ששומרת על חלק מהתכונות הפיזיולוגיות של בלוטת החלב.
בבלוטות החלב, תאי אפיתל החלב הזוהר, האחראים על ייצור החלב, ממוקמים ליד לומן, ואילו תאים myoepithelial מסולקים סביב תאים זוהרים לטפל בתנועות התכווצות המוביל את החלב אל הפטמה. אובדן ארגון תקין בין שושלת תאים אלה הוא תכונה שלטרנספורמציה גידולית 8 שניתן להעריך במבחנה לאחר זיהוי immunofluorescent של סמני שושלת ייחודיים בתרבויות תאים תלת-מימדיים. מאפיין מרכזי נוסף של תאים סרטניים הוא היכולת שלהם לגדול ללא קשר לתאים אחרים ולמטריצה החוץ תאית1. כאשר תאים בריאים נאלצים לגדול בהשעיה, מנגנונים כגון anoikis \u2012 סוג של מוות תאי המושרה בתגובה ניתוק מן מטריצה חוץ תאית \u2012מופעלים 9. התחמקות של מוות תאי הוא אחד סימני ההיכר הייחודיים של סרטן ולכן, תאים שהשתנו מסוגלים להשבית אנויקי ולשרוד באופן בלתי תלוי עוגן. יכולת זו ניתן להעריך במבחנה עם בדיקה עצמאית מעגן באמצעות אגר רך. יתר על כן, תכונה אינהרנטית של רקמות גידולי היא יכולת איתות מתמשך שלהם, אשר ניתן לפקח בקלות תחת תנאים במבחנה על ידי מדידת הגידול של מספר התא לאורך זמן, לא רק בהשעיה assays אלא גם על ידי ניטור קצב הצמיחה של תרבויות חסידות monolayer.
למרות המודל הטוב ביותר לבדיקת פוטנציאל tumorigenic הוא חיסון של תאים סרטניים במודלים מורין והערכת התפתחות הגידול במקום, חשוב למזער את מספר בעלי החיים המועסקים בהליכים ניסיוניים ככל האפשר. לכן, לאחר בדיקות מתאימות כדי להעריך את השינוי במבחנה היא בראש סדר העדיפויות. כאן, אנו מספקים קבוצה של כלים כדי להעריך את הפוטנציאל tumorigenic של תאים אפיתל השד שינוי חלקי לחלוטין שניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות שעובדים עם מודלים טרנספורמציה הסלולר.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים הניסיוניים המתוארים במאמר זה מספקים כלים שימושיים להערכת השינוי האונקוגני של תאים מתורבתים במבחנה. כל טכניקה מעריכה היבטים ספציפיים של תהליך השינוי, ולכן יש להקדיש תשומת לב מיוחדת בעת סיוק מסקנות מניתוח יחיד. הצטברות עקומות צמיחה היא גישה הדורשת מידע שכבר זמין בעת culturing תאים …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מעבדת AG ממומנת על ידי המועצה הספרדית לבטיחות גרעינית. T.A. ו- A.G. הם חברים בקבוצת מחקר המוכרת על ידי Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT מחזיקה בחוזה במימון הקרן המדעית Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. החוזה של ג’י.אף ממומן על ידי מענק מקרן סלקס.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
- Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71 (2008).
- Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422 (2017).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
- Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112 (2015).
- Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65 (2018).
