In Vitro Оценка онкогенной трансформации в эпителиальных клетках молочной железы человека
Summary
Этот протокол предоставляет экспериментальные инструменты in vitro для оценки трансформации клеток молочной железы человека. Описаны подробные шаги по последующей скорости пролиферации клеток, независимой от якорной стоянки способности роста и распределению клеточных линий в 3D-культурах с матрицей мембраны подвала.
Abstract
Tumorigenesis это многоступенчатый процесс, в котором клетки приобретают возможности, которые позволяют их рост, выживание и распространение во враждебных условиях. Различные тесты направлены на выявление и количественную оценку этих признаков раковых клеток; однако, они часто сосредотачиваются на одном аспекте клеточной трансформации и, по сути, для их надлежащей характеристики требуется несколько тестов. Цель этой работы состоит в том, чтобы предоставить исследователям набор инструментов для оценки клеточной трансформации in vitro с широкой точки зрения, что позволяет сделать хорошие выводы.
Устойчивая активация пролиферативной сигнализации является основной особенностью опухолевых тканей и может быть легко контролироваться в условиях in vitro путем расчета количества удвоений населения, достигнутых с течением времени. Кроме того, рост клеток в 3D культурах позволяет их взаимодействие с окружающими клетками, напоминающими то, что происходит в виво. Это позволяет проводить оценку клеточной агрегации и, вместе с иммунофлуоресцентной маркировкой отличительных клеточных маркеров, получать информацию о другой актуальной особенности опухолевой трансформации: потере надлежащей организации. Еще одной замечательной характеристикой трансформировалированных клеток является их способность расти без привязанности к другим клеткам и к внеклеточной матрице, которую можно оценить с помощью анкориджного анализа.
Предусмотрены подробные экспериментальные процедуры оценки темпов роста клеток, выполнения иммунофлуоресцентной маркировки маркеров клеточной линии в 3D-культурах, а также для проверки анкоридж-независимого роста клеток в мягком агаре. Эти методологии оптимизированы для первичной эпителиальной клетки молочной железы (BPEC) из-за его актуальности в рак молочной железы; однако, процедуры могут быть применены к другим типам клеток после некоторых корректировок.
Introduction
Для развития неоплазмы требуется несколько последовательных событий. В 2011 году Шанахан и Вайнберг описали 10 возможностей, которые позволяют трансформировать рост клеток, выживание и распространение: так называемые «Признаки рака»1. Описанная здесь методология составляет три различных инструмента для оценки клеточной трансформации в пробирке, сосредоточив внимание на некоторых отличительных особенностях опухолевых клеток. Эти методы оценивают скорость пролиферации клеток, поведение клеток при культуре в 3D и их способность формировать колонии с независимостью якорной стоянки.
Модели клеток имеют решающее значение для проверки гипотезы in vitro. Разработаны различные подходы для создания экспериментальных моделей клеточной трансформации для изучениярака 2,3,4. Поскольку рак молочной железы является наиболее распространенным раком среди женщин во всем мире и несет ответственность за примерно 15% случаевсмерти от рака среди женщин 5, обеспечивая подходящие клеточные модели клеток млекопитающих эпителиальных клеток имеет первостепенное значение для дальнейшего исследования. В этой статье мы проиллюстрировали потенциал трех методов оценки клеточной трансформации с помощью экспериментальной модели преобразования эпителиальных клеток молочной железы (BPECs), первоначально описанной Ince и коллегами в 20076, а затем реализованной в нашейлаборатории 7. Эта экспериментальная модель основана на последовательном изменении трех целевых генов (SV40 Large T и малых т антигенов, именуемых Ttag, hTERT, и HRAS) к геному не преобразованных BPECs. Кроме того, метод, используемый для производных BPECs способствует поддержанию млекопитающих эпителиальных клеток с люминесцентными или миоэпителиальными маркерами, в результате чего неоднородная культура клеток, которая сохраняет некоторые из физиологических черт молочной железы.
В молочной железе, светящиеся клетки молочной железы эпителиальной, которые отвечают за производство молока, расположены рядом с люменом, в то время как миоэпителиальные клетки удаляются вокруг светящихся клеток и заботиться о сокращениях движений, ведущих молоко к соску. Потеря надлежащей организации между этими клеточными линиями является особенностью опухолевойтрансформации 8, которая может быть оценена в пробирке после иммунофлуоресцентного обнаружения отличительных маркеров линии в культурах 3D-клеток. Другой важной характеристикой опухолевых клеток является их способность расти без привязанности к другим клеткам и к внеклеточной матрице1. Когда здоровые клетки вынуждены расти в подвеске, механизмы, такие как anoikis u2012 тип клеточной смерти, индуцированной в ответ на отделение от внеклеточной матрицы No u2012 активируются9. Уклонение от клеточной смерти является одной из отличительных признаков рака и, таким образом, преобразованные клетки способны инактивировать anoikis и выжить в якорь-независимой манере. Эта емкость может быть оценена в пробирке с якорной независимой анализа с использованием мягкого агара. Кроме того, неотъемлемой особенностью опухолевых тканей является их устойчивая пролиферативная сигнальная способность, которую можно легко контролировать в условиях in vitro путем измерения увеличения количества клеток с течением времени, не только в анализах суспензии, но и путем мониторинга темпов роста монослойных культур адептов.
Несмотря на то, что наилучшей моделью для проверки опухолемного потенциала является прививка опухолевых клеток в моделях мурина и оценка развития опухоли на месте, важно максимально свести к минимуму количество животных, занятых в экспериментальных процедурах. Таким образом, наличие подходящих тестов для оценки трансформации in vitro является главным приоритетом. Здесь мы предоставляем набор инструментов для оценки опухолевых потенциал частично и полностью преобразованных эпителиальных клеток молочной железы, которые могут быть легко реализованы в большинстве лабораторий, которые работают с моделями клеточной трансформации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экспериментальные протоколы, описанные в настоящем документе, предоставляют полезные инструменты для оценки онкогенной трансформации культурных клеток in vitro. Каждый метод оценивает конкретные аспекты процесса трансформации, и, таким образом, особое внимание следует уделять при сост?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Лаборатория AG финансируется Испанским советом по ядерной безопасности. Т.А. и А.Г. являются членами исследовательской группы, признанной генералитатом Каталонии (2017-SGR-503). MT имеет контракт, финансируемый Научным Фондом Asociaci’n Espa’ola Contra el C’ncer (AECC-INVES19022TERR). Контракт G.F. финансируется за счет гранта Фонда Cellex.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
- Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71 (2008).
- Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422 (2017).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
- Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112 (2015).
- Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65 (2018).
