Приготовление обогащенного вирусом инокулята при оральной инфекции медоносных пчел (Apis mellifera)

Summary

Здесь мы описываем два протокола: во-первых, для размножения, извлечения, очистки и количественной оценки большого количества частиц вируса медоносной пчелы без оболочки, включая метод удаления куколок медоносной пчелы, а во-вторых, для проверки последствий вирусной инфекции с использованием высоковоспроизводимого биоанализа в клетке с высокой пропускной способностью.

Abstract

Медоносные пчелы имеют большое экологическое и сельскохозяйственное значение во всем мире, но также подвергаются различным нагрузкам, которые негативно влияют на здоровье пчел, включая воздействие вирусных патогенов. Такие вирусы могут вызывать широкий спектр разрушительных последствий и часто могут быть сложными для изучения из-за множества факторов, которые затрудняют отделение эффектов экспериментального лечения от ранее существовавшей фоновой инфекции. Здесь мы представляем метод массового производства больших количеств вирусных частиц вместе с высокопроизводительным биоанализом для проверки вирусной инфекции и эффектов. В связи с нынешним отсутствием непрерывной, свободной от вирусов клеточной линии медоносных пчел вирусные частицы усиливаются in vivo с использованием куколок медоносных пчел, которые извлекаются из улья в больших объемах с использованием минимально стрессовой методологии. Эти вирусные частицы затем могут быть использованы в биоанализах в клетке медоносных пчел для проверки жизнеспособности инокулы, а также различных других динамик вирусной инфекции, включая взаимодействие с питанием, пестицидами и другими патогенами. Основным преимуществом использования таких частиц является то, что это значительно снижает шансы на введение неизвестных переменных в последующих экспериментах по сравнению с текущими альтернативами, такими как заражение через инфицированную пчелиную гемолимфу или гомогенат, хотя при поиске пчел все же следует соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму фоновое заражение вирусом. Клеточные анализы не заменяют крупномасштабные, реалистичные полевые эксперименты, проверяющие эффекты вирусной инфекции на уровне колонии, а вместо этого функционируют как метод установления базовых вирусных реакций, которые в сочетании с получистыми вирусными частицами могут служить важными инструментами для изучения различных измерений физиологических взаимодействий медоносных пчел и вирусов.

Introduction

Медоносные пчелы (Apis mellifera) играют решающую роль в современном глобальном сельскохозяйственном ландшафте, но в настоящее время страдают от комбинации биотических и абиотических стрессоров, включая воздействие пестицидов, плохой корм, паразитов и патогенов ^1,2. Одним из наиболее важных патогенов, вызывающих озабоченность, являются вирусы, многие из которых переносятся другим из основных стрессоров медоносных пчел, паразитическим клещом Варроа (Деструктор Варроа). Эти вирусы могут вызывать множество негативных эффектов у медоносных пчел, включая снижение выживаемости расплода, дефекты развития и паралич, которые могут привести к полному разрушению улья как до, так и после периодов зимовки ^3,4,5. Хотя были достигнуты многообещающие успехи в разработке технологий, используемых для борьбы с вирусной инфекцией ^6,7,8,9, динамика, с помощью которой многие вирусы размножаются, распространяются и взаимодействуют внутри медоносной пчелы или колонии, все еще плохо изучена ^5,10 . Понимание базовой биологии взаимодействия медоносных пчел и вирусов и их взаимосвязей с другими факторами окружающей среды имеет решающее значение для разработки эффективных методов борьбы с вирусами.

Тем не менее, изучение взаимодействия медоносных пчел и вирусов создает проблемы с многочисленными известными и неизвестными факторами, усложняющими процесс. К ним относятся взаимодействия с диетой^11,12, воздействие пестицидов¹³ и генетический фон пчел^14,15. Даже если сосредоточиться только на вирусной инфекции, осложнения являются общими, потому что популяции медоносных пчел, как управляемые, так и дикие, всегда имеют некоторую степень фоновой вирусной инфекции, хотя часто без проявления острых симптомов ^16,17, а последствия коинфекции вируса не совсем понятны¹⁸. Это затруднило изучение эффектов вируса медоносных пчел.

Многие исследования вируса медоносных пчел использовали косвенные вирусные инфекции для поиска взаимодействий с другими стрессорами, наблюдая, как фоновые инфекции изменяются при других методах лечения 12,19,20,21. Хотя этот подход был успешным в выявлении важных эффектов, особенно в обнаружении того, как пестициды или диетические методы лечения влияют на уровни и репликацию вируса, прививка вирусной обработкой известного содержания и концентрации имеет решающее значение для экспериментального тестирования динамики вирусной инфекции. Тем не менее, отделение экспериментального лечения от фоновой инфекции также может представлять проблемы. В полевых исследованиях исследователи дифференцировали штаммы вируса деформированного крыла (DWV), чтобы предоставить доказательства передачи вируса от медоносных пчел^{шмелям 22}, но использование этого подхода было бы затруднено только для медоносных пчел. Вирусные инфекционные клоны являются мощным инструментом не только для отслеживания инфекции ^23,24,25, но и для обратных генетических исследований вирусов медоносных пчел и для исследований взаимодействия вирус-хозяин 26,27,28. Однако в большинстве случаев инфекционные клоны по-прежнему необходимы для выполнения инфекционного цикла внутри клеток для производства частиц. Такие частицы предпочтительны в качестве инокул для экспериментального лечения, потому что их инфекционность выше, чем у голой вирусной РНК, а инокуляция инкапсидированными геномами имитирует естественную инфекцию.

Производство чистых, незагрязненных инокул вируса медоносных пчел (штаммы вируса дикого типа или штаммы, полученные из инфекционных клонов) также создает проблемы. В первую очередь это связано с трудностями в получении надежной, непрерывно реплицирующейся, безвирусной клеточной линии медоносных пчел для получения вирусов чистого штамма^29,30. Хотя некоторые клеточные линии были произведены, эти системы остаются несовершенными; Тем не менее, есть надежда, что жизнеспособная клеточная линия может быть произведена²⁹, что позволит более точно контролировать производство и исследование вируса. До тех пор, пока такая линия не станет широко доступной, большинство протоколов производства вирусов будут по-прежнему полагаться на использование in vivo вирусов производства и очистки 18,31,32,33,34. Эти подходы включают идентификацию и очистку вирусных частиц, представляющих интерес (или производство инфекционного клона) и использование их для заражения медоносных пчел, обычно в виде куколок. Куколкам вводят вирус-мишень, а затем приносят в жертву, а затем извлекают и очищают частицы. Однако, поскольку ни одна пчела не свободна от вирусов, в любом таком концентрате всегда присутствует некоторая степень заражения от следов других вирусов, и, следовательно, необходимо проявлять большую осторожность при выборе пчел с низкой вероятностью фоновых инфекций. Кроме того, методы удаления куколок из гребенчатых ячеек для использования в этих протоколах³³ являются очень трудоемкими и могут вызывать стресс у пчел, ограничивая производство этими средствами^18,32. Здесь мы сообщаем об альтернативном методе, который позволяет в больших масштабах удалять личинок с небольшим трудом и меньшей механической нагрузкой на пчел.

После того, как куколки получены и введены с начальным вирусным инокулятом, их необходимо инкубировать, чтобы обеспечить вирусу время для репликации. Впоследствии полученные вирусные частицы могут быть переработаны в форму, пригодную для заражения экспериментальных пчел. Существует несколько простых методов для достижения этого, в том числе использование сырого гомогената^35,36 или гемолимфы, полученной от вирусно инфицированных пчел в качестве источника инфекции³⁷. Эти методы эффективны, но имеют большую вероятность введения неизвестных переменных из фонового субстрата (например, других факторов в гомогенатах мертвых пчел). Кроме того, желательно концентрировать частицы, если эксперимент требует введения большой, известной дозы вируса за короткий промежуток времени. Поэтому для лучшего контроля предпочтительнее использовать методы, допускающие некоторый уровень очистки и концентрацию вирусных частиц. Как правило, серия этапов осаждения и центрифугирования приведет к удалению почти всего возможного нецелевого вирусного материала³³.

После получения этого концентрированного инокулята полезно количественно оценить вирусные титры (qPCR) и охарактеризовать его биоанализами in vivo, чтобы проверить его жизнеспособность и способность вызывать смертность, а также подтвердить, что повышенные титры вируса получены после заражения. Это может быть достигнуто с помощью инъекционных экспериментов (либо в куколок, либо во взрослых особей) или экспериментов по кормлению (в личинок или взрослых особей). Хотя все эти подходы возможны, кормление групп взрослых пчел в клетке часто является самым быстрым и простым. Клеточный метод анализа также широко используется для тестирования различных других методов лечения на пчелах, включая токсичность пестицидов³⁸, развитие яичников^{39 и влияние питательных} веществ на поведение^40,41 и, следовательно, может стать хорошей основой для экспериментов, связывающих вирусную инфекцию с другими факторами⁴².

Здесь мы описываем надежный метод получения больших количеств получистых, высокообогащенных вирусных частиц без использования дорогостоящей ультрацентрифуги, включая метод удаления куколок, который уменьшает трудовую и механическую нагрузку на пчел, и высоковоспроизводимый, высокопроизводительный биоанализ для тестирования вирусной инфекции и эффектов. Жестко контролируя чистоту вирусной инокулы, исследователи могут уменьшить вариации вирусного ответа медоносной пчелы по сравнению с другими методами вирусной инокуляции. Кроме того, биоанализ может проверять вирусные эффекты на уровне небольших групп с использованием высоковоспроизводимых экспериментальных единиц перед масштабированием до реалистичных в полевых условиях, что гораздо более трудоемко для управления. В сочетании эти два метода предоставляют необходимые инструменты для исследований, которые могут помочь улучшить наше общее понимание физиологических взаимодействий между медоносными пчелами и вирусом.

Protocol

1. Массовое извлечение пчел Вариант 1: самоудаление личинок Поместите матку медоносных пчел в пустую, вытянутую рамку Лангстрота и верните ее в свою колонию. Дайте матке отложить яйца на этом каркасе в течение 24 ч. Проверьте рамку через 24 часа, чтобы убедиться, что большинство гр…

Representative Results

Успешное следование протоколам (Рисунки 1) для инъекций куколок и вирусной экстракции должно производить большое количество вирусных частиц. Тем не менее, отбор проб и инъекция куколок, полученных из различных колоний в несколько временных точек, максимизируют шансы на приобр…

Discussion

Здесь мы изложили методы, детализирующие каждый этап процесса амплификации вируса и подготовки запасов инокулята, включая сбор личинок и размножение вируса, экстракцию и концентрацию, а также вирусную обработку в виде экспериментов по кормлению в клетке. Эти методы позволяют производ…

Materials

10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375