MS2-аффинная очистка в сочетании с секвенированием РНК у грамположительных бактерий
Summary
Технология MAPS была разработана для тщательного изучения мишеня конкретной регуляторной РНК in vivo. Интересующая сРНК помечена аптамером MS2, позволяющим совместно очищать своих партнеров по РНК и их идентификацию путем секвенирования РНК. Этот модифицированный протокол особенно подходит для грамположительных бактерий.
Abstract
Хотя малые регуляторные РНК (сРНК) широко распространены среди бактериальной области жизни, функции многих из них остаются плохо охарактеризованными, особенно из-за сложности идентификации их мишеней мРНК. Здесь мы описали модифицированный протокол MS2-Affinity Purification в сочетании с технологией секвенирования РНК (MAPS), направленный на выявление всех партнеров РНК конкретной сРНК in vivo. В широком смысле, аптамер MS2 слит с 5′ конечностью интересуемой сРНК. Эта конструкция затем экспрессируется in vivo, позволяя MS2-сРНК взаимодействовать со своими клеточными партнерами. После сбора бактерий клетки механически лизируются. Сырой экстракт загружается в хроматографическую колонку на основе амилозы, предварительно покрытую белком MS2, слитым с мальтозосвязывающим белком. Это позволяет специфически захватывать MS2-сРНК и взаимодействующие РНК. После элюирования совместно очищенные РНК идентифицируются методом высокопроизводительного секвенирования РНК и последующего биоинформационного анализа. Следующий протокол был реализован в грамположительном патогене человека Staphylococcus aureus и, в принципе, транспонируется любым грамположительным бактериям. Подводя итог, можно сказать, что технология MAPS представляет собой эффективный метод глубокого изучения регуляторной сети конкретной сРНК, предлагая снимок всего ее мишени. Однако важно иметь в виду, что мнило, что мнило цели, определенные МАПО, по-прежнему нуждаются в подтверждении взаимодополняющими экспериментальными подходами.
Introduction
Сотни, возможно, даже тысячи мелких регуляторных РНК (сРНК) были идентифицированы в большинстве бактериальных геномов, но функции подавляющего большинства из них остаются нехарактеризованными. В целом, сРНК представляют собой короткие некодирующие молекулы, играющие важную роль в бактериальной физиологии и адаптации к флуктуирующим средам1,2,3. Действительно, эти макромолекулы находятся в центре многочисленных сложных регуляторных сетей, влияющих на метаболические пути, стрессовые реакции, а также на вирулентность и устойчивость к антибиотикам. Логично, что их синтез запускается специфическими раздражителями окружающей среды (например, питательным голоданием, окислительными или мембранными стрессами). Большинство сРНК регулируют множественные целевые мРНК на посткрипционном уровне посредством короткого и несмежного спаривания оснований. Они обычно предотвращают инициацию трансляции, конкурируя с рибосомами за области инициации трансляции4. Образование дуплексов сРНК:мРНК также часто приводит к активной деградации целевой мРНК путем рекрутинга специфических РНК.
Характеристика мишени сРНК (т.е. всего набора ее целевых РНК) позволяет идентифицировать метаболические пути, в которые она вмешивается, и потенциальный сигнал, на который она отвечает. Следовательно, функции конкретной сРНК обычно могут быть выведены из ее мишени. Для этой цели было разработано несколько инструментов прогнозирования in silico, таких как IntaRNA и CopraRNA5,6,7. Они, в частности, полагаются на комплементарность последовательностей, энергию сопряжения и доступность потенциального места взаимодействия для определения предполагаемого партнера сРНК. Однако алгоритмы прогнозирования не интегрируют все факторы, влияющие на парирование оснований in vivo, такие как участие РНК-шаперонов8, благоприятствующих неоптимальным взаимодействиям или совместной экспрессии обоих партнеров. Из-за присущих им ограничений частота ложных срабатываний инструментов прогнозирования остается высокой. Большинство экспериментальных крупномасштабных подходов основаны на совместной очистке пар сРНК:мРНК, взаимодействующих с помеченным РНК-связывающим белком (RBP)6,9. Например, методом взаимодействия РНК путем лигирования и секвенирования (RIL-seq) идентифицировал дуплексы РНК, совместно очищенные с РНК-шаперонами, такими как Hfq и ProQ в Escherichia coli10,11. Аналогичная технология, называемая УФ-сшиванием, лигированием и секвенированием гибридов (CLASH), была применена к RNase E- и Hfq-ассоциированным сРНК в E. coli12,13. Несмотря на хорошо описанную роль Hfq и ProQ в сРН-опосредоточенной регуляции у нескольких бактерий8,14,15,регуляция на основе сРНК, по-видимому, не зависит от РНК-шаперона в нескольких организмах, таких как S. aureus16,17,18. Даже если очистка дуплексов РНК в сочетании с РНКазами осуществима, как показали Уотерс и коллеги13,это остается сложным, поскольку РНКазы вызывают их быструю деградацию. Следовательно, MS2-аффинная очистка в сочетании с подходом19,20 секвенирования РНК (MAPS) представляет собой надежную альтернативу в таких организмах.
В отличие от вышеупомянутых методов, MAPS использует конкретную сРНК в качестве приманки для захвата всех взаимодействующих РНК и, следовательно, не полагается на участие RBP. Весь процесс показан на рисунке 1. Короче говоря, сРНК помечена на 5′ аптамером РНК MS2, который специально распознается белком оболочки MS2. Этот белок сливается с мальтозосвязывающим белком (MBP) для иммобилизации на амилозной смоле. Поэтому MS2-сРНК и ее РНК-партнеры сохраняются на колонке аффинной хроматографии. После элюирования мальтозой коочищенные РНК идентифицируют с помощью высокопроизводительного секвенирования РНК с последующим биоинформатическим анализом(рисунок 2). Технология MAPS в конечном итоге рисует интерактивную карту всех потенциальных взаимодействий, происходящих in vivo.
Технология MAPS изначально была реализована в непатогенной грамотрицательной бактерии E. coli21. Примечательно, что MAPS помог идентифицировать фрагмент, полученный из тРНК, специфически взаимодействующий как с RyhB, так и с RybB sRNAs и предотвращающий любой транскрипционный шум сРНК для регулирования мишеней мРНК в неиндуцирующие условиях. После этого MAPS был успешно применен к другим РНК E. coli, таким как DsrA22,RprA23,CyaR23 и GcvB24 (таблица 1). В дополнение к подтверждению ранее известных целей, MAPS расширил мишень этих хорошо известных сРНК. Недавно MAPS был выполнен в Salmonella Typhimurium и показал, что SraL sRNA связывается с rho mRNA, кодируя фактор прекращения транскрипции25. Благодаря этому спариванию SraL защищает мРНК ро от преждевременного прекращения транскрипции, вызванного самим Ро. Интересно, что эта технология не ограничивается сРНК и может быть применена к любому типу клеточных РНК, примером которого является использование фрагмента26, полученного из тРНК, и 5′-нетранслированнойобласти мРНК 22 (таблица 1).
Метод MAPS также был адаптирован к патогенной грамположительной бактерии S. aureus19. В частности, протокол лизиса был широко модифицирован для эффективного разрыва клеток из-за более толстой клеточной стенки, чем грамотрицательные бактерии, и для поддержания целостности РНК. Этот адаптированный протокол уже разгадал интерактом RsaA27,RsaI28 и RsaC29. Этот подход дал представление о решающей роли этих сРНК в регуляторных механизмах свойств клеточной поверхности, поглощения глюкозы и реакций на окислительный стресс.
Протокол, разработанный и реализованный в E. coli в 2015 году, был недавно подробно описан30. Здесь мы предоставляем модифицированный протокол MAPS, который особенно подходит для изучения регуляторных сетей сРНК у грамположительных (более толстых клеточных стенк) бактерий, будь то непатогенные или патогенные (меры предосторожности).
Protocol
Representative Results
Discussion
Модифицированный протокол для грамположительных бактерий
Исходный протокол МАПС был разработан для изучения интерактома сРНК в модельном организме E. coli20,30. Здесь мы описываем модифицированный протокол, который подходит для характерист…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана «Национальным агентством решершей» (ANR, Грант ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH и ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, для PR). Он также был опубликован в рамках labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 и ANR-17-EURE-0023 (для PR), в качестве финансирования от государства, управляемого ANR в рамках инвестиций в будущую программу. DL была поддержана исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках Грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 753137-SaRNAReg. Работа в E. Massé Lab была поддержана действующими грантами от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR), Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) и Гранта команды Национальных институтов здравоохранения NIH R01 GM092830-06A1.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
Referências
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen – MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3′ external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
- Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
