Generering av dynamiska miljöförhållanden med hjälp av en mikrofluidisk enhet med hög genomströmning
Summary
Vi presenterar ett mikrofluidiskt system för hög genomströmningsstudier på komplexa livsmaskiner, som består av 1500 kulturenheter, en rad förbättrade peristaltiska pumpar och en blandningsmodul på plats. Det mikrofluidiska chippet möjliggör analys av de mycket komplexa och dynamiska mikromiljöförhållandena in vivo.
Abstract
Härma in vivo miljöförhållanden är avgörande för in vitro-studier på komplexa livsmaskiner. Nuvarande tekniker som riktar sig till levande celler och organ är dock antingen mycket dyra, som robotteknik, eller saknar nanolitervolym och millisekekunders tidsnoggrannhet vid vätskemanipulation. Vi presenterar häri design och tillverkning av ett mikrofluidiskt system, som består av 1 500 kulturenheter, en rad förbättrade peristaltiska pumpar och en blandningsmodul på plats. För att demonstrera kapaciteten hos den mikrofluidiska enheten upprätthålls neurala stamcellssfärer (NSC) i det föreslagna systemet. Vi observerade att när NSC-sfären utsätts för CXCL dag 1 och EGF i dag 2, är den rundformade konformationen väl underhållen. Variation i inmatningsordningen för 6 läkemedel orsakar morfologiska förändringar i NSC-sfären och uttrycksnivå representativ markör för NSC-stemness (dvs. Hes5 och Dcx). Dessa resultat tyder på att dynamiska och komplexa miljöförhållanden har stora effekter på NSC-differentiering och självförnyelse, och den föreslagna mikrofluidiska enheten är en lämplig plattform för studier med hög genomströmning på de komplexa livsmaskinerna.
Introduction
Tekniker med hög genomströmning är avgörande för biomedicinska och kliniska studier. Genom att parallellt genomföra miljontals kemiska, genetiska eller levande cell- och organoidtester kan forskare snabbt identifiera gener som modulerar en biomolekylär väg och anpassa sekventiell läkemedelsinmatning till ens specifika behov. Robotik1 och mikrofluidiska chips i kombination med ett enhetskontrollprogram gör det möjligt att automatisera komplexa experimentella procedurer, som omfattar cell-/vävnadsmanipulation, vätskehantering, avbildning och databehandling/datakontroll2,3. Därför kan hundratals och tusentals experimentella tillstånd upprätthållas på ett enda chip, enligt önskad genomströmning4,5.
I detta protokoll beskrev vi design och tillverkning förfarandet för en mikrofluidisk enhet, som består av 1500 kultur enheter, en rad förbättrade peristaltic pumpar och på plats blandning modulus. Cellkulturkammaren på 2 nivåer förhindrar onödig sax under medium utbyte, vilket säkerställer en ostörd kulturmiljö för långsiktig levande cellavbildning. Studierna visar att den föreslagna mikrofluidiska enheten är en lämplig plattform för studier med hög genomströmning av de komplexa livsmaskinerna. Dessutom tillåter de avancerade egenskaperna hos det mikrofluidiska chipet automatiserad beredning av mycket komplexa och dynamiska mikromiljöförhållanden in vivo, som de ständigt växlande cytokinerna och ligandskompositionerna6,7, vars slutförande tar månader för konventionella plattformar som 96-brunnsplatta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Olika mikrofluidiska enheter har utvecklats för att utföra multiplexerade och komplexa experiment17,18,19,20. Mikrobrunnar gjorda av en matris med topologiska urtag kan till exempel fånga enskilda celler utan användning av yttre kraft, som visar fördelaktiga tecken inklusive liten provstorlek, parallellisering, lägre materialkostnad, snabbare svar, högkänslighet 21</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författare bekräftar det tekniska stödet från Zhifeng Cheng från Chansn Instrument (Kina) LTD. Detta arbete stöddes av bidrag (National Natural Science Foundation of China,51927804).
Materials
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
Referências
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
