在这里,我们提出了一种制备和安装 秀丽隐杆线虫 胚胎的方案,在4D显微镜下记录发育并示踪细胞谱系。
4D显微镜是解开不同动物胚胎发育过程的宝贵工具。在过去的几十年里, 秀丽隐杆线虫 已成为研究发育的最佳模型之一。从光学角度来看,其大小和透明体使这种线虫成为DIC(微分干涉对比或Nomarski)显微镜的理想标本。本文说明了生长 秀丽隐杆线 虫,准备和安装其胚胎,进行4D显微镜和细胞谱系示踪的方案。该方法基于Nomarski图像的多焦点延时记录和使用特定软件进行分析。该技术揭示了细胞水平的胚胎发育动力学。突变体中的任何胚胎缺陷,例如纺锤体取向,细胞迁移,凋亡或细胞命运规范方面的问题,都可以有效地检测和评分。实际上,胚胎的每个细胞都可以被跟踪到胚胎开始移动的那一刻。通过4D DIC显微镜追踪 秀丽隐杆线虫 胚胎的完整细胞谱系是费力的,但使用特定软件极大地促进了这项任务。此外,该技术易于在实验室中实现。4D显微镜是一种多功能工具,为胚胎发育进行无与伦比的分析开辟了可能性。
4D显微镜是一种多焦点延时记录系统,允许研究人员在空间上和随时间变化地记录和量化生物样品的细胞动力学。细胞培养物,酵母或活组织可以进行4D分析,但该技术特别适用于分析活胚胎的发育。该分析的分辨率达到胚胎每个细胞的水平。可以检测到每个细胞分裂,并且可以随着时间的推移跟踪细胞运动。根据细胞获得的位置和形状评估细胞的命运。Nomarski光学元件的使用增强了未染色透明样品的对比度,使用干涉焦平面的正交偏振光束。生成的图像显示为三维,一侧发光。
已经开发了基于使用共聚焦显微镜和GFP转基因动物自动检测细胞核和生成细胞谱系的其他方法1,2。这些系统的优势是显而易见的:该软件大大覆盖了在一段时间内手动标记每个原子核的需求(尽管在后期阶段需要一些手动监督)。然而,涉及细胞形状或膜动力学变化的细胞过程,例如在细胞分化,迁移,凋亡或尸体吞噬期间发生的过程,仍然隐藏在荧光标记的细胞核图像中作为黑色背景。
相比之下,4D Nomarski显微镜(也称为DIC显微镜,微分干涉对比显微镜)显示了野生型或突变动物发育过程中发生的细胞核和细胞形状变化。这允许使用标准显微镜进行细胞谱系追踪,仅使用透射光。除了显示特定的表达模式之外,一般不需要使用转基因动物,在这种情况下,荧光扫描可以插入。因此,对于许多从事动态细胞过程(例如胚胎发生或细胞凋亡)的实验室来说,这可能是最佳方法,可以在DIC显微镜下突出显示3,4,5,6,7。
几种灵活且用户友好的程序可用于捕获微观图像并重建记录样品中的细胞谱系,3D模型,细胞迁移路径等。在标准实验中,在一系列焦平面上以恒定的距离获取图像,其数量取决于样品厚度。可以通过增加扫描频率来优化分析的时间分辨率。除了计算机存储容量之外,录制的持续时间几乎没有限制。例如,对于 秀丽隐杆线虫 胚胎发育分析,我们通常每30秒在30个焦平面上采集图像(每个焦平面1微米步长),持续12小时。
这些系统已应用于几种动物胚胎的分析,例如 秀丽隐杆线虫8,9,10, 黑腹果蝇11, 其他线虫胚胎12,13,缓步动物14,15 甚至早期小鼠胚胎16。唯一的要求是具有能够在显微镜下在载玻片上制备的透明胚胎。
综上所述,基于DIC的4D显微镜对于1)分析小型透明动物的胚胎发育特别有用:追踪细胞谱系,细胞迁移路径,生成3D模型等;2)定义基因表达模式;3)研究细胞培养动力学,从酵母到人类细胞;4)分析组织动力学或胚胎片段;5)量化细胞死亡动力学和尸体吞噬;6)基于胚胎发育特征进行比较系统发育分析。如果对这些主题(或类似主题)中的任何一个感兴趣,则可以使用4D显微镜。
现代生物学的主要挑战之一是了解多细胞生物的发育。秀丽隐杆线虫已成为研究发育中胚胎中细胞增殖和细胞分化之间精细协调的最合适模型之一。从光学角度来看,其透明的体和小尺寸使这种线虫成为DIC显微镜的理想标本。具有类似特征的其他生物体也进行了4D显微镜分析11,12,13,14,15,16。
对于这些发育研究,正向或反向遗传学的基因失活为其参与胚胎发生提供了线索。一旦一个基因被证明在发育中发挥作用,下一步就是确定它在建立正确的身体计划方面的确切作用。免疫染色是大多数模型的首选方法。该技术阐明了细胞分化或特定标记物表达中的问题。然而,这种方法的一个主要局限性是,它只提供在开发过程中的固定点上单个或多个标记的表达式的静态视图。这些标记物在整个发育过程中的动态视图只能通过在不同时间点染色不同的胚胎来获得。此外,在这种固定样品中不可能进行细胞谱系重建。
4D显微镜是研究胚胎发育的补充方法。该技术以细胞级分辨率揭示发育动态。胚胎中的任何缺陷,例如纺锤体取向,细胞迁移,凋亡,细胞命运规范等方面的问题都将出现在4D电影中,该电影可以向前和向后可视化,由研究人员进行量化和评分。使用这种技术,胚胎中的几乎每个细胞都可以被跟踪到胚胎开始移动的那一刻。仅用可见光和Nomarski光学器件进行4D显微镜检查的胚胎不会引起光损伤。荧光扫描也可以在记录中插入,以检测基因表达的时间和位置。与标准WT谱系胚胎相比,遭受显着光损伤的胚胎通过细胞周期延长来识别,该细胞周期延长导致强烈的紫外线照射。在这种情况下,可以通过降低紫外灯强度和增加相机灵敏度或曝光时间来减少光损伤。形态学特征和分子标记可以帮助阐明任何突变体的胚胎发育。
在实验室中设置4D显微镜系统很容易实现,经过一些实践,可以在显微镜领域每个细胞的分辨率水平上对细胞动力学和细胞培养物和活透明标本的谱系进行无与伦比的分析。DIC图像上的细胞谱系示踪仍然手工处理。这很耗时,尽管该软件可以检测谱系错误,例如标记同一单元格的不同谱系分支,但错误是可能的。虽然GFP标记细胞的自动检测已经发展良好2,但基于未标记细胞和可见光图像的补充谱系示踪软件仍处于早期阶段,对于完整的胚胎分析并不真正有用。毫无疑问,图像识别系统在可见光显微镜领域的应用将带来这一领域的长足进步。
The authors have nothing to disclose.
作者希望感谢里奥哈·萨卢德基金会(Fondos FEDER)和西班牙科学部长,创新与大学(MCIU)(Grant PGC2018-094276-B-I00)的支持。克里斯蒂娜·罗梅罗·阿兰达(Cristina Romero Aranda)由AECC(Asociación Española Contra el Cáncer)的奖学金资助。
Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |