Visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva peptidica legata al gene calcitonina del topo Cranial Dura Mater con immunofluorescenza e tracciamento neurale
Summary
Qui presentiamo un protocollo per visualizzare la correlazione spaziale delle fibre nervose immunoreattive peptidiche (CGRP) e dei vasi sanguigni correlati al gene calcitonina nel dura mater cranico usando rispettivamente immunofluorescenza e istochimica fluorescente con CGRP e phalloidina. Inoltre, l’origine di queste fibre nervose è stata tracciata retrogradamente con un tracciante neurale fluorescente.
Abstract
Lo scopo di questo studio era quello di esaminare la distribuzione e l’origine delle fibre nervose sensoriali immunoreattive del peptide (CGRP) immunoreattive del basamento cranico utilizzando l’immunofluorescenza, la ricostruzione tridimensionale (3D) e la tecnica di tracciamento retrogrado. Qui, le fibre nervose e i vasi sanguigni sono stati macchiati usando rispettivamente immunofluorescenza e tecniche istochimiche con CGRP e falloidina fluorescente. La correlazione spaziale delle fibre nervose durali CGRP-immuoreattive e dei vasi sanguigni è stata dimostrata dalla ricostruzione 3D. Nel frattempo, l’origine delle fibre nervose immunoreattive CGRP sono state rilevate con la tecnica di tracciamento neurale con fluorogold (FG) dall’area intorno all’arteria meningea media (MMA) nella dura mater cranica al ganglio trigeminale (TG) e gangli della radice dorsale cervicale (C). Inoltre, sono state esaminate anche le caratteristiche chimiche dei neuroni etichettati FG nei TG e nei DRG insieme al CGRP utilizzando doppie immunofluorescenze. Sfruttando il campione trasparente a montaggio intero e la ricostruzione 3D, è stato dimostrato che le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole etichettate con phalloidina corrono insieme o formano separatamente una rete neurovascolare uditivo in una vista 3D, mentre i neuroni etichettati FG sono stati trovati nei rami oftalmico, mascellare e mandibolare del TG, così come nei DRG C2-3 ipsilateral sul lato dell’applicazione del tracciante in cui alcuni dei neuroni etichettati FG presentavano espressione immunoreattiva CGRP. Con questi approcci, abbiamo dimostrato le caratteristiche distributivi delle fibre nervose immunoreattive CGRP intorno ai vasi sanguigni nella dura madre cranico, così come l’origine di queste fibre nervose da TG e DRG. Dal punto di vista metodologico, può fornire un prezioso riferimento per comprendere la complicata struttura neurovascolare del dura mater cranicio sotto la condizione fisiologica o patologica.
Introduction
Il dura mater cranico è lo strato più esterno di meningi per proteggere il cervello e contiene abbondanti vasi sanguigni e diversi tipi di fibre nervose1,2. Molti studi hanno dimostrato che la dura mater cranici sensibilizzata può essere il fattore chiave che porta al verificarsi di mal di testa, che coinvolge la vasodilatazione e l’innervazioneanomale 3,4,5. Pertanto, la conoscenza della struttura neurovascolare nella dura madre cranale è importante per comprendere la patogenesi del mal di testa, specialmente per l’emicrania.
Sebbene l’innervazione dura sia stata precedentemente studiata con l’immunoistochimica convenzionale, la correlazione spaziale delle fibre nervose e dei vasi sanguigni nella dura madre cranico è statameno studiata 6,7,8,9. Al fine di rivelare la struttura neurovascolare durale in modo più dettagliato, peptide correlato al gene calcitonina (CGRP) e phalloidin sono stati selezionati come marcatori per la colorazione rispettivamente delle fibre nervose durali e dei vasi sanguigni nella dura madre cranale a montaggio intero con immunofluorescenza e istochimica fluorescente10. Può essere una scelta ottimale ottenere una visione tridimensionale (3D) della struttura neurovascolare. Inoltre, il fluorogold (FG) è stato applicato sull’area intorno all’arteria meningea media (MMA) nel dura mater cranico per determinare l’origine delle fibre nervose immunoreattive CGRP, e rintracciato al ganglio trigemino (TG) e ai gangli della radice dorsale cervicale (C), mentre i neuroni etichettati FG sono stati ulteriormente esaminati insieme alla CGRP usando l’immunofluorescenza.
Lo scopo di questo studio era quello di fornire uno strumento efficace per studiare la struttura neurovascolare nella dura mater cranale per l’innervazione immunoreattiva CGRP e la sua origine. Sfruttando il dura mater trasparente a montaggio intero e combinando l’immunofluorescenza, il tracciamento retrogrado, le tecniche confocali e la ricostruzione 3D, ci aspettavamo di presentare una nuova visione 3D della struttura neurovascolare nella dura mater cranale. Questi approcci metodologici possono essere ulteriormente serviti per esplorare la patogenesi di diversi mal di testa.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato con successo la distribuzione e l’origine delle fibre nervose cgrp-immunoreattive nel dura mater cranico utilizzando l’immunofluorescenza, la ricostruzione 3D e gli approcci di tracciamento neurale con anticorpo CGRP e tracciante neurale FG, fornendo le evidenze istologiche e chimiche per comprendere meglio la rete neurovascolare udirica.
Come era noto, il CGRP svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi dell’emicrania4,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dal progetto del National Key R&D Program of China (Project Code n. 2019YFC1709103; n. 2018YFC1707804) e National Natural Science Foundation of China (Project Code n. 81774211; n. 81774432; n. 81801561).
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
Referências
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neurociência. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint “Taichong” (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neurociência. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
