Identification, isolement et caractérisation des progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) et des progéniteurs myogéniques (MP) dans le muscle squelettique chez le rat
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour isoler les progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) et les progéniteurs myogéniques (MP) du muscle squelettique du rat. L’utilisation du rat dans les modèles de lésions musculaires offre une disponibilité accrue des tissus du muscle atrophique pour l’analyse et un plus grand répertoire de méthodes validées pour évaluer la force musculaire et la démarche chez les animaux en mouvement libre.
Abstract
Les progéniteurs fibro-adipogènes (PAP) sont des cellules interstitielles résidentes dans le muscle squelettique qui, avec les progéniteurs myogéniques (MP), jouent un rôle clé dans l’homéostasie musculaire, les blessures et la réparation. Les protocoles actuels d’identification et d’isolement des PAF utilisent la cytométrie en flux / tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et des études évaluant leur fonction in vivo à ce jour ont été entreprises exclusivement chez la souris. La plus grande taille inhérente du rat permet une analyse plus complète des PAF dans les modèles de lésions musculaires squelettiques, en particulier dans les muscles gravement atrophiques ou lorsque les chercheurs ont besoin d’une masse tissulaire importante pour effectuer plusieurs essais en aval. Le rat fournit en outre une plus grande sélection de tests fonctionnels musculaires qui ne nécessitent pas de sédation ou de sacrifice animal, minimisant ainsi la morbidité et l’utilisation des animaux en permettant des évaluations en série. Les protocoles de cytométrie en flux/FACS optimisés pour les souris sont spécifiques à l’espèce, notamment limités par les caractéristiques des anticorps disponibles dans le commerce. Ils n’ont pas été optimisés pour séparer les PAF des muscles rat ou hautement fibrotiques. Un protocole de cytométrie en flux / FACS pour l’identification et l’isolement des PAF et des MP du muscle squelettique de rat sain et dénervé a été développé, en s’appuyant sur l’expression différentielle des marqueurs de surface CD31, CD45, Sca-1 et VCAM-1. Comme les anticorps primaires spécifiques au rat et validés par cytométrie en flux sont sévèrement limités, une conjugaison interne de l’anticorps ciblant Sca-1 a été effectuée. À l’aide de ce protocole, la conjugaison Sca-1 réussie a été confirmée et l’identification cytométrique en flux des PAP et des MP a été validée par culture cellulaire et immunocoloration des PAP et des MSP isolés du FACS. Enfin, nous rapportons un nouveau cours temporel des PAF dans un modèle de dénervation prolongée (14 semaines) du rat. Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier les PAF dans un nouveau modèle animal.
Introduction
Les cellules progénitrices fibro-adipogènes (MAP) sont une population de cellules progénitrices multipotentes résidentes dans le muscle squelettique qui jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie, la réparation et la régénération musculaires et, inversement, interviennent également dans les réponses pathologiques aux lésions musculaires. Comme leur nom l’indique, les PAF ont été identifiés à l’origine comme une population progénitrice ayant le potentiel de se différencier en fibroblastes et adipocytes1 et étaient censés être les principaux médiateurs de l’infiltration fibro-graisseuse du muscle squelettique dans les blessures et les maladies chroniques. Une étude plus approfondie a révélé que les PAF sont en outre capables d’ostéogenèse et de chondrogenèse2,3,4. Ainsi, ils sont plus largement notés dans la littérature comme des progéniteurs mésenchymateux oustromaux 3,5,6,7,8. Dans les lésions musculaires squelettiques aiguës, les PAF aident indirectement à la myogenèse régénérative en proliférant transitoirement pour fournir un environnement favorable aux cellules satellites musculaires activées et à leurs homologues progéniteurs myogéniques (MP) en aval1,9,10. Parallèlement à une régénération réussie, les PAF subissent une apoptose, ramenant leur nombre aux niveaux de base1,9,10,11. En revanche, dans les lésions musculaires chroniques, les FAP remplacent les signaux pro-apoptotiques, ce qui entraîne leur persistance9,10,11 et une réparation musculaire anormale.
Des études in vivo évaluant les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les PAF interviennent dans les réponses musculaires ont utilisé des modèles animaux murins à ce jour1,7,9,10, 11,12,13,14. Bien que les souris génétiquement modifiées soient des outils puissants à utiliser dans ces analyses, la petite taille de l’animal limite la disponibilité des tissus pour l’étude dans des modèles de lésions localisées à long terme où l’atrophie musculaire peut être profonde, comme la dénervation traumatique. En outre, la mesure de la force musculaire et de la fonction physique nécessite des mesures ex vivo ou in situ qui nécessitent l’arrêt de la souris, ou des méthodes in vivo qui nécessitent une intervention chirurgicale et / ou une anesthésie générale pour permettre l’évaluation de la performance contractile musculaire15,16,17,18,19,20 . Chez le rat, il existe des analyses fonctionnelles musculaires bien validées et utilisées à l’échelle mondiale, en plus des analyses de comportements moteurs plus complexes tels que l’analyse de la démarche (par exemple, indice de la fonction sciatique, analyse CatWalk) et sont effectuées chez des animaux éveillés et en mouvement spontané21,22,23,24 . Cela optimise en outre les principes de morbidité minimale dans l’expérimentation animale et le nombre d’animaux de recherche utilisés. Le rat offre ainsi à l’investigateur des PAF la flexibilité supplémentaire d’un plus grand volume musculaire blessé pour les analyses protéiques et cellulaires et la capacité d’entreprendre des évaluations en série de l’activité et des comportements fonctionnels statiques et dynamiques complexes musculaires chez l’animal alerte.
Les PAF ont principalement été identifiés et isolés à partir d’échantillons de muscles entiers à l’aide de la cytométrie en flux et du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) respectivement. Il s’agit de tests laser capables d’identifier plusieurs populations cellulaires spécifiques en fonction de caractéristiques telles que la taille, la granularité et une combinaison spécifique de marqueurs de surface cellulaire ou intracellulaires25. Ceci est très avantageux dans l’étude d’un système d’organes tel que le muscle squelettique, car l’homéostasie et la régénération sont des processus complexes et multifactoriels coordonnés par une pléthore de types de cellules. Une étude séminale a identifié des PAF, ainsi que des MP, en utilisant des méthodes de cytométrie en flux dans le muscle squelettique de souris1. Ils ont démontré que les PAF sont de nature mésenchymateuse, car ils manquaient d’antigènes de surface spécifiques aux cellules d’origine endothéliale (CD31), hématopoïétique (CD45) ou myogénique (Intégrine-α7 [ITGA7]), mais ont exprimé le marqueur de cellules souches mésenchymateuses Sca-1 (antigène de cellules souches 1)1 et différenciés en cellules fibrogéniques et adipogéniques en culture. D’autres études ont démontré l’isolement réussi des progéniteurs mésenchymateux dans les muscles sur la base de l’expression d’un marqueur alternatif de cellules souches, le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα)2,7,8 et une analyse plus approfondie a révélé qu’il s’agissait probablement de la même population cellulaire que les FAPs3. Les PAF sont maintenant couramment identifiés en cytométrie en flux en utilisant Sca-1 ou PDGFRα comme marqueur de sélection positif1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . L’utilisation de PDGFRα est préférentielle pour les tissus humains cependant, car un homologue humain direct de Sca-1 murin n’a pas encore été identifié32. En outre, d’autres protéines de surface cellulaire ont été rapportées comme marqueurs des MP (par exemple, VCAM-1), offrant une alternative potentielle à ITGA7 comme indicateur des cellules de lignée myogénique pendant l’isolement des PAF33.
Alors que la cytométrie en flux / FACS est une méthodologie puissante pour étudier le rôle et le potentiel pathogène des FAP dans le muscle squelettique1,9,10,11,13,29, elle est limitée techniquement par la spécificité et l’optimisation de ses réactifs requis. Étant donné que l’identification cytométrique en flux et l’isolement des PAP ont été développés et menés dans des modèles animaux murins1,9, 10,11,29, cela pose des défis aux chercheurs qui souhaitent étudier les PAE dans d’autres organismes modèles. De nombreux facteurs – tels que la taille optimale des tissus à traiter, ainsi que la spécificité et la disponibilité des réactifs et / ou des anticorps – diffèrent selon les espèces utilisées.
En plus des obstacles techniques à l’étude des PAP dans un nouveau modèle animal, ils ont été largement étudiés dans un contexte aigu et toxique – généralement par injection chimique intramusculaire ou cardiotoxine. L’évaluation de la dynamique à long terme des PAF se limite principalement à l’évaluation de la dystrophie musculaire de Duchenne, à l’aide du modèle de souris mdx9,10,11, et de modèles de lésions musculaires combinées telles que la déchirure massive de la coiffe des rotateurs où la transsection et la dénervation simultanées du tendon sont effectuées sur la musculature del’épaule26,27,28 . La réponse des PAF à la seule insulte de dénervation traumatique chronique, un phénomène fréquent dans les accidents du travail dans l’industrie lourde, l’agriculture et dans les traumatismes à la naissance (lésion du plexus brachial)34,35,36,37 avec une morbidité significative, n’a pas été aussi bien caractérisée, souvent limitée à une période de courte durée11,38.
Nous décrivons une méthode pour identifier et isoler les PAP et les MP des muscles squelettiques sains, sévèrement atrophiques et fibrotiques chez le rat. Tout d’abord, l’identification des MAP CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- et des MP CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ à l’aide d’un protocole de digestion tissulaire et de coloration par cytométrie en flux est démontrée et la validation ultérieure de nos résultats est effectuée par culture et coloration immunocytochimique de cellules isolées du FACS. En utilisant cette méthode, nous rapportons également un nouveau cours temporel des PAF dans un modèle de lésion de dénervation isolée à long terme chez le rat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocole d’isolement des PAP optimisé et validé pour le muscle du rat est essentiel pour les chercheurs qui souhaitent étudier des modèles de blessures qui ne sont pas réalisables chez la souris pour des raisons biologiques ou techniques. Par exemple, les souris ne sont pas un modèle animal optimal pour étudier les lésions chroniques locales ou neurodégénératives telles que la dénervation à long terme. Biologiquement, la courte durée de vie et le vieillissement rapide des souris rendent difficile la d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les installations de base de cytométrie en flux de l’Université d’Ottawa et le Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC) de l’Hôpital St Michaels Unity Health Toronto pour leur expertise et leurs conseils en matière d’optimisation du protocole de cytométrie en flux/FACS présenté dans ce manuscrit. Ce travail a été financé par Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) à JB.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
| 20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
| Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
| Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | — | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
| Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | — | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocytometer | Reichert | N/A | |
| HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
| Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
| Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
| Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
| LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | — | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | — | |
| Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
| Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
| Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
| Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
| Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
| Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
| Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
| Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
| Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
| Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
| Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
| Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
| Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
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