تقييم الخصائص الوعائية الوراثية للخلايا الشبيهة بسرطان المبيض باستخدام نظام الثقافة المشتركة ثلاثي الأبعاد ، NICO-1
Summary
الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSC) هي المسؤولة عن بدء السرطان ، والتكرار ، والمقاومة العلاجية ، وورم خبيث. يعتبر مكانة الأوعية الدموية OCSC لتعزيز التجديد الذاتي ل OCSCs ، مما يؤدي إلى المقاومة الكيميائية. يوفر هذا البروتوكول الأساس لإنشاء نموذج متخصص للأوعية الدموية OCSC قابل للتكرار في المختبر.
Abstract
تتواجد الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) في مكان داعم ، وتشكل بيئة دقيقة تتكون من خلايا انسجة مجاورة وأوعية ومصفوفة خارج الخلية. تشكل قدرة CSCs على المشاركة في تطوير البطانة خاصية مهمة تساهم بشكل مباشر في الفهم العام لآليات تكوين الورم وورم خبيث للورم. الغرض من هذا العمل هو إنشاء منهجية قابلة للتكرار للتحقيق في قدرة الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSCs) على بدء الورم. هنا ، قمنا بفحص آلية الأوعية الدموية الجديدة بين الخلايا البطانية و OCSCs جنبا إلى جنب مع التغيرات المورفولوجية للخلايا البطانية باستخدام نموذج الثقافة المشتركة في المختبر NICO-1. يسمح هذا البروتوكول بتصور خطوة الأوعية الدموية الجديدة المحيطة ب OCSCs بطريقة الدورة الزمنية. يمكن أن توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة فيما يتعلق بالخصائص الوعائية ل OCSCs في ورم خبيث للورم.
Introduction
سرطان المبيض هو ثامن أكثر الأورام الخبيثة شيوعا بين النساء في جميع أنحاء العالم ، مع ما يقرب من 300,000 تشخيص جديد وما يقدر بنحو 180,000 حالة وفاة سنويا1. عند التشخيص الأولي ، غالبا ما يظهر سرطان المبيض بأعراض حادة ، حيث يكون حوالي 75٪ من المرضى بالفعل في المرحلة الثالثة والرابعة. وفقا لذلك ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات هو <30٪ ومعدل الوفيات هو الأعلى بين سرطانات أمراض النساء2 ، مع كفاءة علاج سرطان المبيض تعتمد بشكل كبير على العوامل السريرية مثل الإنجاز الناجح لجراحة debulking ، ومقاومة العلاج الكيميائي ، والتكرار بعد العلاج الأولي.
يتم تنظيم أنسجة سرطان المبيض بشكل هرمي ، حيث لا تكون جميع مكونات الورم قادرة على توليد أحفاد متساوية. تعتبر الخلايا الوحيدة القادرة على التجديد الذاتي وإنتاج مجموعة من الخلايا السرطانية غير المتجانسة تمثل الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs)3. يرافق التجديد الذاتي ل CSC وبدء الورم تعزيز تكوين الأوعية لإعادة تشكيل البيئة المكروية للورم لغرض الحفاظ على مكانة داعمة. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام النماذج السابقة للتحليلات المختبرية بسبب التكاثر المحدود لزراعة الخلايا الجذعية السرطانية المشتقة من العينات السريرية بسبب تعطيل الأجسام الكروية بعد المرور المتعدد. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق تجريبية لزراعة الخلايا الجذعية السرطانية من المرضى لعدة تطبيقات4،5،6،7. على وجه الخصوص ، من خلال استغلال خاصية CSCs للنمو عن طريق تكوين كرويات في ألواح ربط منخفضة للغاية مع وسط خال من المصل ، يتم حث الخلايا الجذعية السرطانية المزروعة على التعبير عن علامة سطح الخلية الجذعية التي لا يتم التعبير عنها في الخلايا السرطانية الطبيعية مع إمكانية التمايز متعدد السلالات 8,9.
أظهرت البيانات الحديثة أن استمرار المبيض الخامل (O) CSCs الذي يتم تصوره على أنه انتشار في الصفاق يرتبط بتجديدها كأورام متكررة10. وبالتالي فإن فهم السمات الجزيئية والبيولوجية ل OCSCs قد يسمح بالاستهداف الفعال لهذه الخلايا واستئصالها ، مما يؤدي إلى مغفرة الورم المحتملة. على وجه الخصوص ، لا يعرف سوى القليل فيما يتعلق بالسمات الميكانيكية الخلوية والجزيئية لأدوار CSCs في تكوين الأوعيةالدموية 11. لذلك ، في البروتوكول الحالي ، استخدمنا OCSCs المشتقة من المريض في بيئة مخبرية للتحقيق في خاصية تولد الأوعية الدموية للخلايا البطانية باستخدام نموذج الثقافة المشتركة ، والذي قد يحاكي البيئة المكروية للورم في الخلايا الجذعية السرطانية والخلايا البطانية في الموقع النقيلي في الإعداد السريري. في نهاية المطاف ، نظرا لأن الأوعية الدموية الجديدة تشكل عملية حاسمة ضرورية لدعم نمو الورم وورم خبيث ، فإن الفهم الأفضل لآليته سيسمح بتطوير علاج استهداف جديد ل OCSCs في الموقع النقيلي.
هنا ، نقدم بروتوكولا لتصور خطوة الأوعية الدموية الجديدة المحيطة ب CSCs بطريقة الدورة الزمنية. تتضمن ميزة البروتوكول السماح بإجراء تحقيقات قابلة للتكرار بالكامل باستخدام نظام الاستزراع المشترك ثلاثي الأبعاد ، NICO-1 ، مما يسمح بمراقبة التأثيرات على المرضى من قدرة بدء الورم المشتقة من OCSC أثناء تكوين الأوعية الدموية للخلايا البطانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول المقدم كيفية محاكاة البيئة المكروية للورم في OCSCs في بيئة معملية. يشكل المكون الأساسي للطريقة نموذج الاستزراع المشترك القابل للتكرار بدرجة كبيرة والذي تم الحصول عليه باستخدام نظام NICO-1 ، وهو نظام استزراع مشترك غير مباشر في Transwell. تدرس العديد من نماذج الاستزراع المشترك المتاح…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة معونة للبحث العلمي C (منحة رقم 19K09834 إلى K.N.) من وزارة التعليم والعلوم والثقافة ، اليابان.
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
Referências
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Pesquisa do Câncer. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Pesquisa do Câncer. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Pesquisa do Câncer. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
