Cytométrie en flux à haute dimensionnalité pour l’analyse de la fonction immunitaire de tissus implantaires disséqués
Summary
L’isolement de cellules à partir d’implants disséqués et leur caractérisation par cytométrie en flux peuvent contribuer de manière significative à la compréhension du schéma de réponse immunitaire contre les implants. Cet article décrit une méthode précise pour l’isolement de cellules d’implants disséqués et leur coloration pour l’analyse par cytométrie en flux.
Abstract
Le succès de l’implantation d’un tissu cultivé en laboratoire ou d’un dispositif médical chez un individu dépend de la réponse immunitaire de l’hôte receveur. Si l’on considère un implant comme un corps étranger, une réponse immunitaire hostile et dérégulée peut entraîner le rejet de l’implant, tandis qu’une réponse régulée et la récupération de l’homéostasie peuvent conduire à son acceptation. L’analyse des microenvironnements d’implants disséqués dans des contextes de vivo ou ex vivo peut aider à comprendre le modèle de réponse immunitaire, ce qui peut finalement aider à développer de nouvelles générations de biomatériaux. La cytométrie en flux est une technique bien connue pour caractériser les cellules immunitaires et leurs sous-ensembles en fonction de leurs marqueurs de surface cellulaire. Cette revue décrit un protocole basé sur le découpage manuel en dés, la digestion enzymatique et la filtration à travers un tamis cellulaire pour l’isolement de suspensions cellulaires uniformes à partir de tissus implantaires disséqués. De plus, un protocole de coloration par cytométrie en flux multicolore a été expliqué, ainsi que des étapes pour les réglages initiaux du cytomètre afin de caractériser et de quantifier ces cellules isolées par cytométrie en flux.
Introduction
Les progrès dans le domaine de la médecine ont conduit à l’utilisation fréquente de matériaux implantés pour soutenir la fonction ou la repousse des tissus endommagés 1,2. Il s’agit notamment de dispositifs tels que les stimulateurs cardiaques, les implants cosmétiques reconstructifs et les plaques orthopédiques utilisées pour la fixation des fractures osseuses 3,4. Cependant, les matériaux utilisés pour fabriquer ces implants et les endroits où ils sont implantés jouent un rôle important dans la détermination du succès de ces implants 5,6,7. En tant que corps étrangers, ces implants peuvent générer une réponse immunitaire de la part de l’hôte qui peut conduire soit au rejet, soit à la tolérance8. Ce facteur a conduit la recherche sur les biomatériaux à générer des matériaux capables d’attirer la réponse immunitaire souhaitée après l’implantation 9,10,11,12.
La réponse immunitaire est une exigence essentielle dans le domaine de la médecine régénérative, où un tissu ou un organe est cultivé autour d’un squelette de biomatériau (échafaudage) dans un laboratoire pour le remplacement d’un tissu ou d’un organe endommagé13,14,15,16. En médecine régénérative, l’objectif est de remplacer les tissus manquants ou endommagés par l’utilisation de cellules, de signaux et d’échafaudages, chacun pouvant être fortement modulé par les réponses immunitaires17. De plus, même lorsqu’une absence de réponse immunitaire est souhaitée, c’est très rarement une absence d’activité immunitaire plutôt que la présence d’un profil régulateur qui est souhaitée18. Des techniques telles que la cytométrie en flux peuvent jouer un rôle important dans la caractérisation du modèle de réponse immunitaire à divers biomatériaux utilisés pour le revêtement des dispositifs implantaires ou pour le développement d’échafaudages pour l’ingénierie tissulaire19.
Ces informations, à leur tour, aideront à développer des biomatériaux pour les implants qui peuvent être bien tolérés par le système immunitaire ou à développer des échafaudages qui peuvent jouer un rôle constructif dans l’ingénierie tissulaire. La préparation correcte des échantillons pour l’analyse par cytométrie en flux est une étape importante pour éviter des résultats inexacts dans la caractérisation immunitaire par tri cellulaire activé par fluorescence20,21. Par conséquent, cette revue présente une méthodologie détaillée qui peut être utilisée pour l’isolement des cellules du tissu d’échafaudage, la coloration de la suspension cellulaire et l’analyse par cytométrie en flux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette revue décrit une méthodologie détaillée pour isoler les cellules des implants de biomatériaux afin d’obtenir une suspension cellulaire uniforme. De plus, un protocole détaillé a été fourni pour la coloration de la suspension cellulaire pour la cytométrie en flux multicolore, ainsi que les étapes de configuration d’un cytomètre en flux pour des résultats optimaux. Les méthodes d’isolement cellulaire peuvent impliquer plusieurs étapes, utilisant souvent la dissection manuelle des tissus suivie d?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée en partie par le programme de recherche intra-muros du NIH, y compris l’Institut national d’imagerie biomédicale et de bio-ingénierie. Avis de non-responsabilité : Les NIH, leurs dirigeants et leurs employés ne recommandent ni n’approuvent aucune entreprise, produit ou service.
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
Referências
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