Produktion af IgG Fusion Proteiner Transiently Udtrykt i Nicotiana benthamiana

Summary

Vi beskriver her en simpel metode til udtryk, ekstraktion og rensning af rekombinant menneskelige IgG smeltet til GFP i Nicotiana benthamiana. Denne protokol kan udvides til rensning og visualisering af mange proteiner, der udnytter kolonnekromatografi. Desuden er protokollen kan tilpasses til in-person og virtuelle college undervisning laboratorium, der giver projektbaseret udforskning.

Abstract

Stor efterspørgsel efter antistoffer som terapeutiske indgreb for forskellige smitsomme, metaboliske, autoimmune, neoplastiske og andre sygdomme skaber et stigende behov for at udvikle effektive metoder til rekombinant antistofproduktion. Fra 2019 var der mere end 70 FDA-godkendte monoklonale antistoffer, og der er eksponentielt vækstpotentiale. På trods af deres løfte, begrænsende faktorer for udbredt brug er produktionsomkostninger og kompleksitet. Potentielt tilbyder planter billige, sikre og let skalerbare proteinfremstillingsstrategier. Planter som Nicotiana benthamiana ikke kun kan korrekt folde og samle komplekse pattedyr proteiner, men også kan tilføje kritiske post-translationelle ændringer svarende til dem, der tilbydes af pattedyr cellekulturer. I dette arbejde, ved hjælp af indfødte GFP og en syre-stabil variant af grønne fluorescerende protein (GFP) smeltet til menneskelige monoklonale antistoffer, vi var i stand til at visualisere hele forbigående antistof udtryk og rensning proces fra N. benthamiana planter. Afhængigt af eksperimentets formål kan oprindelig GFP-fusion sikre lettere visualisering i ekspressionsfasen i planterne, mens syresabil GFP-fusion giver mulighed for visualisering under downstream-behandling. Denne skalerbare og enkle procedure kan udføres af en enkelt forsker til at producere milligram mængder af meget rent antistof eller antistof fusion proteiner i løbet af få dage ved hjælp af kun et par små planter. En sådan teknik kan udvides til visualisering af enhver form for antistofrensningsproces og potentielt mange andre proteiner, både i plante- og andre ekspressionssystemer. Desuden kan disse teknikker gavne virtuelle instruktioner og blive udført i et undervisningslaboratorium af bachelorstuderende, der besidder minimal forudgående erfaring med molekylærbiologiske teknikker, hvilket giver et fundament for projektbaseret udforskning med applikationer fra den virkelige verden.

Introduction

Industri rapporter viser, at tretten ud af de tyve mest ekstrapolationsfaktoren narkotika i USA var biologi (protein-baserede lægemidler), hvoraf ni var antistoffer. Fra og med 2019 var der over 570 antistof (Ab) terapeutiske lægemidler i forskellige kliniske^{udviklingsfaser 1,2,3.} Det nuværende globale Ab-salg overstiger 100^mia. Med så stor efterspørgsel og forventede stigninger i indtægterne, forskere har arbejdet på at udvikle måder at producere Ab terapeutiske på en stadig større skala, med højere kvalitet og lavere omkostninger. Plantebaserede ekspressionssystemer har flere fordele i forhold til traditionelle pattedyrcellelinjer til økonomisk overkommelig og storstilet fremstilling af Ab therapeutics^5,6. Produktion af proteinterapeuter i planter (“molekylær pharming”) kræver ikke dyre bioreaktorer eller cellekulturfaciliteter som traditionelle pattedyrcellekulturteknikker^7,8. Planter kan ikke indgå kontrakter med humane patogener, hvilket minimerer potentiel^{forurening 9}. Både forbigående og forbigående plantebaseret proteinudtryk kan anvendes som billigere alternativer til pattedyr eller bakterieproduktionssystemer¹⁰. Selvom transgene planter foretrækkes til afgrødeproduktion, kan rekombinant proteinproduktion ved hjælp af denne metode kræve uger til måneder. Fremskridt i forbigående udtryk ved hjælp af virale vektorer gennem enten sprøjte eller vakuumagroinfiltrering giver mulighed for henholdsvis små og store produktioner af det ønskede protein i^{dag 11,12,13,14}. Produktion af mAbs mod ebola, Dengue og, Zika, og mange andre rekombinant proteiner, er blevet produceret og renset hurtigt og effektivt ved hjælp af forbigående udtryk i N. benthamiana planter^{15,16,17,18,19}. Disse omstændigheder gør forbigående plantebaseret udtryk til en attraktiv mulighed for at udvikle flere Ab-behandlingsformer og de metoder , der er demonstreret i denne^{protokol 20}.

Første generations mAbs var af murinafledning, hvilket resulterede i ikke-specifik immunogenicitet, når de blev anvendt i forsøg med^{mennesker 21}. Over tid, kimære, humaniseret, og i sidste ende, fuldt menneskelige Abs blev produceret for at mindske immunogenicitet induceret af Ab terapeutiske. Desværre, nogle af disse Abs stadig forårsage vært immunogenicitet på grund af forskelle i glycosylering²¹. Udviklingen inden for anlægsteknik har gjort det muligt at ændre Ab glycans, hvilket er afgørende, da ab’s stabilitet og funktion i væsentlig grad kan påvirkes af dens glycosylationstilstand²². Fremskridt har gjort det muligt at producere i plantesystemer af højt niveau udtryk for humaniserede mAbs, der indeholder menneskelige glycaner og deraf følgende de ønskede biologiske træk af en masseproduceret human^{farmaceutisk 19,21}.

Ud over rekombinant Abs, Ab fusion molekyler (Ab fusioner) er blevet undersøgt til forskellige formål i de seneste årtier. Ab fusioner består ofte af et Ab- eller Ab-fragment, der smeltes sammen med et molekyle eller protein, og er designet til at fremkalde reaktioner fra immuneffektorceller²³. Disse molekyler er blevet skabt som potentielle terapeutiske indgreb til behandling af forskellige patologier såsom kræft og autoimmune sygdomme^24,25,26,27. Rekombinant immunkomplekser (FC) er en anden klasse af Ab fusioner, der har været ansat som vaccine kandidater²⁸. RIA’er udnytter immunsystemets evne til at genkende Fc-regioner ab fusioner og har vist sig at forbedre immunogeniciteten, når det kombineres med andre vaccineplatforme^29,30,31.

Green Fluorescerende Protein (GFP) er et bioluminescerende protein fra vandmænd Aequorea Victoria, som udsender grønt lys, når ophidset af ultraviolet lys^32,33. I årenes løb har GFP’s brug som en visuel markør for genekspression udvidet fra udtryk i Escherichia coli til talrige proteinudsetrykssystemer, herunder N. benthamiana planter^{34,35,36,37,38}. Synlige markører, såsom GFP, har rigelige konsekvenser i undervisningen og læring af videnskabelige begreber. Talrige entry-level studerende beskriver vanskeligheder gribe videnskabelige begreber, når den idé, der undervises ikke er synlig for det blotte øje, såsom begreberne molekylærbiologi og^{beslægtede områder 39}. Visuelle markører, som GFP, kan således bidrage til behandlingen af oplysninger i forbindelse med de videnskabelige processer og kan bidrage til at mindske de vanskeligheder, de studerende rapporterer i at lære en lang række videnskabelige begreber.

Selvom GFP ofte bruges som markør til at angive gene og ekspression in vivo, er det vanskeligt at visualisere det i downstream-processerne, hvis der anvendes sure tilstande. Denne omstændighed skyldes primært , at GFP ikke bevarer sin struktur og deraf følgende fluorescens ved en lav pH⁴⁰. Midlertidige sure miljøer er ofte påkrævet i forskellige rensningsprocesser, såsom protein G, protein A, og protein L kromatografi, ofte udnyttet til Ab^{rensning 41,42,43,44}. GFP-mutanter er blevet anvendt til at bevare fluorescens under sure forhold^45,46.

Heri beskriver vi en simpel metode til udtryk, ekstraktion og rensning af rekombinant IgG fusion proteiner i N. benthamiana planter. Vi producerede traditionelle GFP smeltet til N-endinus af en humaniseret IgG tung kæde, hvilket skaber en GFP-IgG fusion. Samtidig udviklede vi sammensmeltning af en fabriks codon-optimeret sekvens for en syre-stabil GFP (asGFP) til N-endinus af en humaniseret IgG tung kæde, hvilket skaber en asGFP-IgG fusion. Fordelene ved at producere GFP-IgG omfatter evnen til at visualisere tilstedeværelsen af et målprotein under ekspression, mens asGFP-IgG tillader at se tilstedeværelsen af rekombinant protein i ikke kun udtrykket og ekstraktionstrinene, men også i rensningstrinnene af proteinet. Denne protokol kan tilpasses til produktion, rensning og visualisering af en række GFP fusionsproteiner produceret i N. benthamiana og renses ved hjælp af kromatografiteknikker, der kræver lav pH. Processen kan også skræddersys til forskellige mængder bladmateriale. Mens Abs og fusion proteiner mærket med GFP eller asGFP ikke er beregnet til at blive brugt til behandlinger, disse metoder kan være nyttige som kontrol under eksperimenter og kan også yderligere udnyttes som et pædagogisk redskab til molekylær og cellulær biologi og bioteknologi, både in-person og næsten.

Protocol

1. Dyrk N. benthamiana planter Placer jord tørv pellets på en bakke og hæld tidligere kogt, stadig varm (~ 40-45 °C), vand over tørv pellets for fuld ekspansion. Efter pellets er fuldt udvidet, sted 2-3 N. benthamiana frø på hver tørv pellet ved hjælp af pincet. Hæld omkring 0,5 i vand til at dække bunden af bakken. Mærkning af bakken med såningsdatoen. Fortsæt med at vande planterne dagligt med passende mængder gødning. Gødning (van…

Representative Results

Denne undersøgelse viser en nem og hurtig metode til at producere rekombinant proteiner og visualisere dem i hele downstream processer. Ved hjælp af N. benthamiana og efter den medfølgende protokol kan rekombinant proteinproduktion, der er beskrevet her, opnås på mindre end en uge. Den overordnede arbejdsgang for planteudtryk, udvinding og rensning er vist i figur 1. Stadierne af plantevækst fra 2 uger gamle planter, 4 uger gamle planter og 6 uger gamle planter vises i <strong…

Discussion

Denne protokol kan anvendes til visuel verifikation af ethvert rekombinant Ab- eller rekombinant protein, der produceres i N. benthamiana-planter, herunder dem, der kræver midlertidig eksponering for sure miljøer til^{kolonnerensning 42,43,44}. Desuden kan fusion af asGFP til andre proteiner i forskellige udtrykssystemer være et nyttigt redskab til eksperimentel visualisering og uddannelse. Protokollen heri kan yderlige…

Materials

5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182