Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à Nicotiana benthamiana

Summary

Nous décrivons ici une méthode simple pour l’expression, l’extraction, et la purification de l’IgG humain recombinant fusionné au GFP dans Nicotiana benthamiana. Ce protocole peut être étendu à la purification et à la visualisation de nombreuses protéines qui utilisent la chromatographie des colonnes. De plus, le protocole s’adapte au laboratoire d’enseignement collégial virtuel et en personne, offrant une exploration axée sur des projets.

Abstract

La forte demande d’anticorps en tant qu’interventions thérapeutiques pour diverses maladies infectieuses, métaboliques, auto-immunes, néoplastiques et autres crée un besoin croissant de développer des méthodes efficaces pour la production d’anticorps recombinants. En 2019, il y avait plus de 70 anticorps monoclonaux approuvés par la FDA, et il y a un potentiel de croissance exponentiel. Malgré leur promesse, les coûts de fabrication et la complexité sont des facteurs limitants pour une utilisation généralisée. Potentiellement, les usines offrent des stratégies de fabrication de protéines peu rentables, sûres et facilement évolutives. Des plantes comme Nicotiana benthamiana peuvent non seulement plier et assembler correctement des protéines mammifères complexes, mais aussi ajouter des modifications post-translationnelles critiques semblables à celles offertes par les cultures cellulaires mammifères. Dans ce travail, en utilisant le GFP indigène et une variante acide-stable de protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée aux anticorps monoclonaux humains, nous avons pu visualiser l’ensemble du processus transitoire d’expression et de purification d’anticorps des usines de N. benthamiana. Selon le but de l’expérience, la fusion GFP native peut assurer une visualisation plus facile pendant la phase d’expression dans les plantes, tandis que la fusion GFP acidulée permet une visualisation pendant le traitement en aval. Cette procédure évolutive et simple peut être effectuée par un seul chercheur pour produire des quantités milligrammes de protéines de fusion d’anticorps ou d’anticorps très pures en quelques jours en utilisant seulement quelques petites plantes. Une telle technique peut être étendue à la visualisation de tout type de processus de purification des anticorps et potentiellement de nombreuses autres protéines, à la fois dans les systèmes végétaux et d’autres systèmes d’expression. En outre, ces techniques peuvent bénéficier d’instructions virtuelles et être exécutées dans un laboratoire d’enseignement par des étudiants de premier cycle possédant une expérience minimale préalable avec les techniques de biologie moléculaire, fournissant une base pour l’exploration basée sur des projets avec des applications réelles.

Introduction

Les rapports de l’industrie indiquent que treize des vingt médicaments les plus riches aux États-Unis étaient des produits biologiques (produits pharmaceutiques à base de protéines), dont neuf étaient des anticorps. En 2019, il y avait plus de 570 anticorps (Ab) thérapeutiques à différentes phases^{de développement clinique 1,2,3}. Les ventes mondiales actuelles d’Ab dépassent les 100 milliards USD, et le marché thérapeutique monoclonal ab (mAb) devrait générer jusqu’à 300 milliards usd d’ici 2025^1,4. Avec une demande aussi forte et des augmentations prévues des revenus, les chercheurs ont travaillé à développer des moyens de produire des produits thérapeutiques Ab à une échelle toujours plus grande, avec une meilleure qualité et des coûts inférieurs. Les systèmes d’expression à base de plantes ont plusieurs avantages par rapport aux lignées cellulaires mammifères traditionnelles pour la fabrication abordable et à grande échelle d’Ab therapeutics^5,6. La production de protéines thérapeutiques dans les plantes (« pharming moléculaire ») ne nécessite pas de bioréacteurs coûteux ou d’installations de culture cellulaire, tout comme les techniques traditionnelles de culture cellulaire^{des mammifères 7,8}. Les plantes ne peuvent pas contracter d’agents pathogènes humains, ce qui minimise la contamination^{potentielle 9}. L’expression transitoire et transgénique des protéines végétales peut être utilisée comme alternative à moindre coût aux systèmes de production de mammifères ou de bactéries¹⁰. Bien que les plantes transgéniques soient préférées pour la production agricole, la production de protéines recombinantes à l’aide de cette méthode peut nécessiter des semaines à des mois. Les progrès de l’expression transitoire à l’aide de vecteurs viraux par l’agroinfiltration seringue ou vide permettent la production à petite et à grande échelle, respectivement, de la protéine désirée dans^{les jours 11,12,13,14}. La production de mAbs contre Ebola, dengue et Zika, et de nombreuses autres protéines recombinantes, ont été produites et purifiées rapidement et efficacement en utilisant l’expression transitoire dans les plantes de N. benthamiana ^{15,16,17,18,19}. Ces circonstances font de l’expression végétale transitoire une option attrayante pour développer plusieurs ab thérapeutiques et les méthodes démontrées dans ce protocole²⁰.

Les mAbs de première génération étaient de dérivation murine, qui a eu comme conséquence l’immunogénicité non spécifique une fois employée dans les essais humains^21. Au fil du temps, chimérique, humanisé, et finalement, abs entièrement humains ont été produites pour diminuer l’immunogénicité induite par ab thérapeutique. Malheureusement, certains de ces abs causent encore l’immunogénicité d’hôte due aux différences dans la glycosylation^21. Les développements dans l’ingénierie végétale ont permis la modification d’Ab glycans, qui est essentielle puisque la stabilité et la fonction d’un Ab peuvent être sensiblement affectées par son état de glycosylation^22. Les progrès ont permis la production dans les systèmes végétaux d’expression de haut niveau de mAbs humanisés, contenant des glycanes humains et, par conséquent, les traits biologiques désirés d’un produit pharmaceutique humain^{produit en série 19,21}.

En plus des abs recombinants, les molécules de fusion Ab (Fusions Ab) ont été explorées à diverses fins au cours des dernières décennies. Ab fusions se composent souvent d’un ab ou ab fragment fusionné à une molécule ou une protéine et sont conçus pour obtenir des réponses des cellules effectrices immunitaires²³. Ces molécules ont été créées comme interventions thérapeutiques potentielles pour traiter diverses pathologies telles que le cancer et les maladies auto-immunes^24,25,26,27. Les complexes immunitaires recombinants (CCI) sont une autre classe de fusions Ab qui ont été utilisées comme candidats vaccins²⁸. Les CCI profitent de la capacité du système immunitaire à reconnaître les régions fc des fusions Ab et ont été trouvés pour améliorer l’immunogénicité lorsqu’ils sont combinés avec d’autres^{plates-formes vaccinales 29,30,31}.

La protéine fluorescente verte (GFP) est une protéine bioluminescente dérivée de la méduse Aequorea Victoria, qui émet de la lumière verte lorsqu’elle est excitée par la lumière^{ultraviolette 32,33}. Au fil des ans, l’utilisation de GFP comme marqueur visuel de l’expression des gènes est passé de l’expression chez Escherichia coli à de nombreux systèmes d’expression protéique, y compris les plantes N. benthamiana ^{34,35,36,37,38}. Les marqueurs visibles, tels que le GFP, ont des implications abondantes dans l’enseignement et l’apprentissage des concepts scientifiques. De nombreux étudiants d’entrée de gamme décrivent des difficultés à saisir des concepts scientifiques lorsque l’idée enseignée n’est pas visible à l’œil nu, comme les concepts de biologie moléculaire et les domaines^{connexes 39}. Les marqueurs visuels, comme le GFP, peuvent ainsi contribuer au traitement de l’information liée aux processus scientifiques et pourraient aider à atténuer les difficultés que les élèves signalent dans l’apprentissage de nombreux concepts scientifiques.

Bien que le GFP soit souvent utilisé comme marqueur pour indiquer le gène et l’expression in vivo,il est difficile de le visualiser dans les processus en aval si l’on utilise des conditions acides. Cette circonstance est principalement parce que GFP ne maintient pas sa structure et la fluorescence qui en résulte à un faible pH⁴⁰. Des environnements acides temporaires sont souvent nécessaires dans divers processus de purification, tels que la protéine G, la protéine A et la chromatographie L protéique, souvent utilisée pour la purification ab^41,42,43,44. Mutants GFP ont été utilisés pour retenir la fluorescence dans des conditions acides^45,46.

Nous décrivons ici une méthode simple pour l’expression, l’extraction et la purification des protéines de fusion IgG recombinantes dans les plantes de N. benthamiana. Nous avons produit le GFP traditionnel fusionné au N-terminus d’une chaîne lourde humanisée d’IgG, créant une fusion GFP-IgG. Simultanément, nous avons développé la fusion d’une séquence optimisée par codon végétal pour un GFP acidulé (asGFP) au N-terminus d’une chaîne lourde humanisée d’IgG, créant une fusion asGFP-IgG. Les avantages de la production de GFP-IgG comprennent la capacité de visualiser la présence d’une protéine cible pendant l’expression, tandis que asGFP-IgG permet de voir la présence de protéines recombinantes non seulement dans les étapes d’expression et d’extraction, mais aussi dans les étapes de purification de la protéine. Ce protocole peut être adapté pour la production, la purification et la visualisation d’une gamme de protéines de fusion GFP produites en N. benthamiana et purifiées à l’aide de techniques de chromatographie qui nécessitent un faible pH. Le processus peut également être adapté à diverses quantités de matériaux foliiques. Bien que les abs et les protéines de fusion étiquetées avec GFP ou asGFP ne soient pas destinés à être utilisés pour des thérapies, ces méthodes peuvent être utiles comme témoins pendant les expériences et peuvent également être utilisées comme un outil d’enseignement pour la biologie moléculaire et cellulaire et la biotechnologie, en personne et virtuellement.

Protocol

1. Cultiver les plantes de N. benthamiana Déposer les granulés de tourbe du sol sur un plateau et verser les granulés de tourbe préalablement bouillis, encore chauds (~40-45 °C), l’eau sur les granulés de tourbe pour une expansion complète. Une fois les granulés complètement extensés, placez 2-3 graines de benthamiana N. sur chaque granule de tourbe à l’aide d’une pince à épiler. Verser environ 0,5 dans l’eau pour couvrir le fon…

Representative Results

Cette étude démontre une méthode facile et rapide pour produire des protéines recombinantes et les visualiser tout au long des processus en aval. En utilisant N. benthamiana et en suivant le protocole fourni, la production de protéines recombinantes décrite ici peut être réalisée en moins d’une semaine. Le flux de travail global de l’expression, de l’extraction et de la purification des plantes est indiqué à la figure 1. Les stades de croissance des plantes à parti…

Discussion

Ce protocole peut être utilisé pour la vérification visuelle de tout Ab recombinant ou protéine recombinante produite dans les plantes de N. benthamiana, y compris celles qui nécessitent une exposition temporaire à des environnements acides à des fins de purification des^{colonnes 42,43,44}. En outre, la fusion de l’asGFP à d’autres protéines dans différents systèmes d’expression peut être un outil utile …

Materials

5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182