니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산
Summary
우리는 니코티아나 벤타미안에서GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 여기에서 설명한다. 이 프로토콜은 열 크로마토그래피를 활용하는 수많은 단백질의 정제 및 시각화로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 직접 및 가상 대학 교육 실험실에 적용되어 프로젝트 기반 탐사를 제공합니다.
Abstract
다양한 전염성, 대사, 자가면역, 신플라스틱 및 기타 질병에 대한 치료 개입으로서 항체에 대한 수요가 높아지면서 재조합 항체 생산을 위한 효율적인 방법을 개발할 필요성이 증가하고 있다. 2019년 현재, FDA승인 단일클론 항체가 70개 이상 있었으며 기하급수적인 성장 잠재력이 있습니다. 그들의 약속에도 불구하고, 광범위한 사용에 대한 제한 요인은 제조 비용과 복잡성입니다. 잠재적으로 식물은 저비용, 안전하며 쉽게 확장 가능한 단백질 제조 전략을 제공합니다. 니코티아나 벤타미안과 같은 식물은 복잡한 포유류 단백질을 올바르게 접고 조립할 수 없을 뿐만 아니라 포유류 세포 배양에서 제공하는 것과 유사한 중요한 번역 후 수정을 추가할 수 있습니다. 본 작품에서는, 인간 단일클론 항체에 융합된 녹색 형광 단백질(GFP)의 원종 GFP 및 산안정변체를 사용하여, 우리는 N. 벤타미안 식물로부터 의 전체 과도 항체 발현 및 정화 과정을 시각화할 수 있었다. 실험의 목적에 따라 네이티브 GFP 융합은 식물의 발현 단계에서 쉽게 시각화할 수 있으며, 산안정성 GFP 융합은 다운스트림 처리 중에 시각화를 가능하게 합니다. 이 확장 가능하고 간단한 절차는 몇 가지 작은 식물을 사용하여 며칠 만에 고도로 순수한 항체 또는 항체 융합 단백질의 밀리그램 양을 생산하는 단일 연구원에 의해 수행 될 수있다. 이러한 기술은 식물 및 기타 발현 시스템에서 모든 유형의 항체 정제 공정 및 잠재적으로 많은 다른 단백질의 시각화로 확장될 수 있다. 또한, 이러한 기술은 가상 지침에 도움이 될 수 있으며 분자 생물학 기술에 대한 최소한의 사전 경험을 가진 학부 생에 의해 교육 실험실에서 실행될 수 있으며, 실제 응용 프로그램과 프로젝트 기반 탐사를위한 토대를 제공합니다.
Introduction
업계 보고서에 따르면 미국에서 가장 많이 매출을 기록한 20개 중 13개 약물은 생물학적 제제(단백질 기반 의약품)였으며, 그 중 9개가 항체였습니다. 2019년 현재, 다양한 임상 개발상에서570개 이상의 항체(Ab) 치료제가1,2,3하였다. 현재 글로벌 Ab 매출은 1,000억 달러를 초과하며, 단일클론 Ab(mAb) 치료제 시장은 2025년1,4년까지최대 3,000억 달러를 창출할 것으로 예상됩니다. 이러한 높은 수요와 예상 된 수익 증가로, 연구원은 더 높은 품질과 낮은 비용으로, 그 어느 때보 다 큰 규모로 Ab 치료제를 생산하는 방법을 개발하기 위해 노력하고있다. 식물계 발현 시스템은 Ab 치료제5,6의저렴하고 대규모 제조를 위해 전통적인 포유류 세포주보다 몇 가지 장점이 있다. 식물에서 단백질 치료제의 생산(“분자 파밍”)은 전통적인 포유류 세포 배양기술7,8과같이 고가의 생물반응기 또는 세포 배양 시설을 필요로 하지 않는다. 식물은 인간의 병원균을 계약할 수 없으므로 잠재적 오염 을 최소화할 수 없습니다 9. 과도 및 형질 전환 식물 기반 단백질 발현 은 포유류 또는 세균 성 생산 시스템(10)에대한 저비용 대안으로 활용 될 수있다. 형질 전환 식물은 작물 생산을 위해 선호되지만,이 방법을 사용하여 재조합 단백질 생산은 몇 주에서 몇 달이 필요할 수 있습니다. 주사기 또는 진공 농약침을 통해 바이러스 벡터를 이용한 과도발현의 어드밴스는11일,12,13,14일에원하는 단백질의 각각 소규모 및 대규모 생산을허용한다. 에볼라, 뎅기열 및 지카 및 수많은 다른 재조합 단백질에 대한 mAbs의 생산은 N. 벤타미안 식물15,16,17,18,19에서일시적인 발현을 사용하여 신속하고 효율적으로 생산및 정제되었다. 이러한 상황은 과도 식물 기반 발현을 다중 Ab 치료제 및 이프로토콜(20)에서입증된 방법을 개발하기 위한 매력적인 옵션으로 만든다.
1세대 mAbs는 뮤린 유도체였으며, 인체실험(21)에서사용될 때 비특이적 면역원성으로 귀결되었다. 시간이 지남에 따라, 키메라, 인간화, 그리고 결국, 완전히 인간 복근은 Ab 치료에 의해 유도된 면역원성을 감소시키기 위하여 생성되었다. 불행히도, 이러한 복근 중 일부는 여전히글리코실화(21)의차이로 인해 숙주 면역원성을 유발한다. 식물 공학의 개발은 Ab glycans의 수정을 허용했으며, 이는 Ab의 안정성과 기능이 글리코실화상태(22)의영향을 크게 받을 수 있기 때문에 필수적입니다. 어드밴스는 인간 글리칸을 함유하고 그 결과 대량 생산된 인간 약제19,21의원하는 생물학적 특성을 포함하는 인간화된 mAbs의 높은 수준의 발현의 식물 시스템에서 생산을 허용하고 있다.
재조합 복근 이외에, Ab 융합 분자 (Ab 퓨전) 최근 수십 년 동안 다양한 목적을 위해 탐구되었습니다. Ab 퓨전은 종종 분자 또는 단백질에 융합된 Ab 또는 Ab 단편으로 구성되며 면역 이펙터세포(23)로부터반응을 유도하도록 설계되었습니다. 이들 분자는암 및 자가면역질환(24,25,26,27)과같은 다양한 병리를 치료하는 잠재적 치료 내정간섭으로 만들어졌다. 재조합 면역 복합체(RIC)는 백신지원자(28)로채용된 또 다른 종류의 Ab 퓨전이다. RI는 Ab fusions의 Fc 영역을 인식하는 면역 계통의 능력을 이용하고 다른 백신플랫폼(29,30,31)과결합될 때 면역원성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
녹색 형광 단백질 (GFP)은 자외선32,33에의해 흥분 될 때 녹색 빛을 방출 해파리 Aequorea 빅토리아에서 파생 된 생물 발광 단백질이다. 수년에 걸쳐, 유전자 발현의 시각적 마커로서의 GFP의 사용은 에샤리치아 대장균의 발현에서 N. 벤타미안 식물34,35,36,37,38을포함한 수많은 단백질 발현 시스템으로 확장되었다. GFP와 같은 눈에 보이는 마커는 과학적 개념의 가르침과 학습에 풍부한 영향을 미칩니다. 수많은 엔트리 레벨 학생들은 가르쳐지는 아이디어가 분자 생물학 및 관련 분야39의개념과 같은 육안으로 보이지 않을 때 과학적 개념을 파악하는 데 어려움을 설명합니다. GFP와 같은 시각적 마커는 과학적 과정과 관련된 정보 처리에 기여할 수 있으며 학생들이 수많은 과학적 개념을 배우는 데 보고하는 어려움을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
GFP는 생체 내에서유전자와 발현을 나타내는 마커로 자주 사용되지만 산성 조건을 사용하는 경우 다운스트림 공정에서 시각화하기가 어렵습니다. 이러한 상황은 주로 GFP가 낮은 pH40에서구조및 그 결과 형광을 유지하지 않기 때문이다. 일시적인 산성 환경은 단백질 G, 단백질 A 및 단백질 L 크로마토그래피와 같은 다양한 정제 공정에서 종종 요구되며, 종종 Ab 정제41,42,43,44에활용된다. GFP 돌연변이체는 산성 조건 하에서 형광을 유지하기 위해 사용되어 왔다45,46.
본 원에서 우리는 N. 벤타미안 식물에서 재조합 IgG 융합 단백질의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 우리는 인간화된 IgG 헤비 체인의 N 종단에 융합된 전통적인 GFP를 생산하여 GFP-IgG 융합을 만들었습니다. 동시에, 우리는 인간화 된 IgG 무거운 체인의 N 종기에 산 안정 GFP (asGFP)에 대한 식물 코돈 최적화 서열의 융합을 개발하여 asGFP-IgG 융합을 만들었습니다. GFP-IgG를 생산하는 장점은 발현 중에 표적 단백질의 존재를 시각화하는 기능을 포함하고, asGFP-IgG는 발현 및 추출 단계뿐만 아니라 단백질의 정제 단계에서 재조합 단백질의 존재를 볼 수 있게 한다. 이 프로토콜은 N. benthamiana에서 생산된 다양한 GFP 융합 단백질의 생산, 정제 및 시각화에 적응하고 낮은 pH를 요구하는 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 이 과정은 또한 잎 재료의 다양한 양에 맞게 조정할 수 있습니다. GFP 또는 asGFP로 태그된 Abs 및 융합 단백질은 치료에 사용되지 않지만, 이러한 방법은 실험 중 대조군으로 유용할 수 있으며, 직접 및 사실상 분자 및 세포 생물학 및 생명 공학을 위한 교육 도구로 더 활용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이러한 프로토콜은 N. 벤타미안 식물에서 생산되는 임의의 재조합 Ab 또는 재조합 단백질의 시각적 검증을 위해 활용될 수 있으며, 여기에는 열 정화목적42,43,44에대한 산성 환경에 일시적으로 노출이 필요한 단백질이 포함된다. 더욱이, 다른 발현 시스템에서 다른 단백질에 asGFP의 융합은 실험적인 시각화 및 교육을 위한…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비디오를 편집 마리아 피아 디팔마 감사합니다. 우리는 또한 그들의 관대 한 출판 수수료 지원에 대한 애리조나 주립 대학의 교육 봉사 및 학생 서비스 사무실에 감사드립니다. 이 프로토콜에 대한 연구는 생명 과학 의 학교에 의해 지원되었다, 애리조나 주립 대학.
Materials
| 5 mL syringe | any | N/A | |
| 50 mL syringe | any | N/A | |
| Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
| Blender with cups | any | N/A | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
| Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
| HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
| Heating block | any reputable supplier | N/A | |
| Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
| Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
| KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
| KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
| KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
| MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
| Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
| Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
| Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
| NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
| PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
| Polypropylene Column | any | N/A | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
| Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
| Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
| Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
| Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
| Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
| TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
| Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
| Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
| UV lamp | any | N/A | |
| Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
| Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |
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