Produktion av IgG Fusion Proteiner Övergående Uttryckt i Nicotiana benthamiana

Summary

Vi beskriver här en enkel metod för uttryck, extraktion, och rening av rekombinanta mänskliga IgG smält till GFP i Nicotiana benthamiana. Detta protokoll kan utvidgas till rening och visualisering av ett flertal proteiner som utnyttjar kolumnkromatografi. Dessutom är protokollet anpassningsbart till det personrelaterade och virtuella collegeundervisningslaboratoriet, vilket ger projektbaserad utforskning.

Abstract

Hög efterfrågan på antikroppar som terapeutiska ingrepp för olika infektiösa, metabola, autoimmuna, neoplastiska, och andra sjukdomar skapar ett växande behov av att utveckla effektiva metoder för rekombinant antikroppsproduktion. Från och med 2019 fanns det mer än 70 FDA-godkända monoklonala antikroppar, och det finns exponentiell tillväxtpotential. Trots deras löfte, begränsande faktorer för utbredd användning är tillverkningskostnader och komplexitet. Potentiellt, växter erbjuder billiga, säkra och lätt skalbara strategier proteintillverkning. Växter som Nicotiana benthamiana inte bara kan korrekt vika och montera komplexa däggdjurproteiner men också kan lägga till kritiska post-translationella ändringar liknande dem som erbjuds av däggdjurscellkulturer. I detta arbete, genom att använda inhemska GFP och en syra-stabil variant av gröna fluorescerande protein (GFP) smält till mänskliga monoklonala antikroppar, kunde vi visualisera hela övergående antikropp uttryck och rening process från N. benthamiana växter. Beroende på experimentets syfte kan inhemsk GFP-fusion säkerställa enklare visualisering under uttrycksfasen i växterna, medan syrastabil GFP-fusion möjliggör visualisering under nedströmsbearbetning. Denna skalbara och okomplicerade förfarande kan utföras av en enda forskare för att producera milligram mängder av mycket ren antikropp eller antikroppar fusion proteiner på några dagar med bara några små växter. En sådan teknik kan utvidgas till visualisering av någon typ av antikroppsreningsprocess och potentiellt många andra proteiner, både i växt- och andra uttryckssystem. Dessutom kan dessa tekniker gynna virtuella instruktioner och utföras i ett undervisningslaboratorium av studenter som har minimal tidigare erfarenhet av molekylärbiologiska tekniker, vilket ger en grund för projektbaserad utforskning med verkliga tillämpningar.

Introduction

Branschrapporter visar att tretton av de tjugo mest högt inkomstbringande läkemedel i USA var biologiska läkemedel (proteinbaserade läkemedel), varav nio var antikroppar. Från och med 2019 fanns det över 570 antikropps -(Ab) therapeutics vid olika kliniska^{utvecklingsfaser 1,2,3}. Nuvarande globala Ab försäljning överstiger 100 miljarder USD, och monoklonala Ab (mAb) terapeutiska marknaden förväntas generera upp till 300 miljarder USD 2025^1,4. Med så hög efterfrågan och beräknade ökningar av intäkterna, forskare har arbetat för att utveckla sätt att producera Ab therapeutics på en allt större skala, med högre kvalitet och lägre kostnader. Växtbaserade uttryckssystem har flera fördelar jämfört med traditionella däggdjurscelllinjer för prisvärd och storskalig tillverkning av Ab therapeutics^5,6. Produktion av protein therapeutics i växter (“molekylär pharming”) kräver inte dyra bioreaktorer eller cellodlingsanläggningar som gör traditionella tekniker för däggdjurscellodling^7,8. Växter kan inte kontrakt mänskliga patogener, minimera potentiella kontaminering⁹. Både övergående och transgent växtbaserat proteinuttryck kan utnyttjas som billigare alternativ till system för produktion av däggdjur eller bakteriell produktion¹⁰. Även om transgena växter är att föredra för växtodling, kan rekombinant proteinproduktion med denna metod kräva veckor till månader. Framsteg i transienta uttryck med hjälp av virala vektorer genom antingen spruta eller vakuum agroinfiltration möjliggör små- och storskalig produktion, respektive, av det önskade proteinet i^{dagar 11,12,13,14}. Produktion av mAbs mot ebola, Dengue och, Zika, och många andra rekombinanta proteiner, har producerats och renats snabbt och effektivt med hjälp av övergående uttryck i N. benthamiana växter^{15,16,17,18,19}. Dessa omständigheter gör övergående växtbaserat uttryck ett attraktivt alternativ för att utveckla flera Ab-therapeutics och de metoder som visas i detta protokoll²⁰.

Första generationens mAbs var av murin härledning, vilket resulterade i icke-specifik immunogenicitet när den används i mänskliga försök²¹. Med tiden, chimeric, humaniserade, och så småningom, helt mänskliga Abs producerades för att minska immunogenicitet inducerad av Ab therapeutics. Tyvärr, några av dessa Abs orsakar fortfarande värd immunogenicitet på grund av skillnader i glycosylation²¹. Utvecklingen inom anläggningsbyggnad har möjlig gjort det möjligt för modifiering av Ab-glyknaner, vilket är väsentligt eftersom en Ab:s stabilitet och funktion avsevärt kan påverkas av dess glykosyleringstillstånd²². Framsteg har möjlig gjort produktion i växtsystem av hög nivå uttryck för humaniserade mAbs, som innehåller mänskliga glykaner och resultantly de önskade biologiska drag av en massproducerad humana läkemedel^19,21.

Förutom rekombinanta Abs, Ab fusion molekyler (Ab fusioner) har undersökts för olika ändamål under de senaste decennierna. Ab fusioner består ofta av en Ab eller Ab fragment smält till en molekyl eller protein och är utformade för att framkalla svar från immun effektor celler²³. Dessa molekyler har skapats som potentiella terapeutiska ingrepp för att behandla olika patologier som cancer och autoimmuna sjukdomar^24,25,26,27. Rekombinanta immunkomplex (RI) är en annan klass av Ab-fusioner som har anställts som vaccinkandidater²⁸. RIC dra nytta av immunsystemets förmåga att känna igen Fc regioner av Ab fusioner och har befunnits förbättra immunogenicitet när de kombineras med andra vaccin plattformar^29,30,31.

Green Fluorescent Protein (GFP) är ett bioluminescerande protein som härrör från maneter Aequorea Victoria, som avger grönt ljus när upphetsad av ultraviolett^{ljus 32,33}. Under årens lopp har GFP: s användning som en visuell markör för genuttryck expanderat från uttryck i Escherichia coli till ett flertal proteinuttryck system, inklusive N. benthamiana växter^{34,35,36,37,38}. Synliga markörer, såsom GFP, har rikliga konsekvenser i undervisningen och inlärningen av vetenskapliga begrepp. Många nybörjarstudenter beskriver svårigheter att förstå vetenskapliga begrepp när idén som lärs ut inte är synlig för blotta ögat, såsom begreppen molekylärbiologi och relaterade områden³⁹. Visuella markörer, som GFP, kan alltså bidra till bearbetning av information som rör de vetenskapliga processerna och skulle kunna bidra till att minska de svårigheter som eleverna rapporterar att lära sig många vetenskapliga begrepp.

Även om GFP ofta används som en markör för att indikera gen och uttryck in vivo, är det svårt att visualisera det i nedströmsprocesserna om du använder sura förhållanden. Denna omständighet beror främst på att GFP inte upprätthåller sin struktur och resulterande fluorescens vid ett lågt pH⁴⁰. Tillfälliga sura miljöer krävs ofta i olika reningsprocesser, såsom protein G, protein A, och protein L kromatografi, ofta utnyttjas för Ab rening^41,42,43,44. GFP mutanter har använts för att behålla fluorescens under sura förhållanden^45,46.

Häri beskriver vi en enkel metod för uttryck, extraktion, och rening av rekombinanta IgG fusion proteiner i N. benthamiana växter. Vi producerade traditionella GFP smält till N-ändstationen av en humaniserad IgG tung kedja, skapa en GFP-IgG fusion. Samtidigt utvecklade vi fusionen av en växt kodonoptimerad sekvens för en syra-stabil GFP (asGFP) till N-ändstationen av en humaniserad IgG tung kedja, skapa en asGFP-IgG fusion. Fördelarna med att producera GFP-IgG inkluderar möjligheten att visualisera förekomsten av ett målprotein under uttryck, medan asGFP-IgG tillåter att se förekomsten av rekombinant protein i inte bara uttrycket och extraktionsstegen utan också i reningsstegen av proteinet. Detta protokoll kan anpassas för produktion, rening, och visualisering av en rad GFP fusion proteiner som produceras i N. benthamiana och renas med hjälp av kromatografi tekniker som kräver lågt pH. Processen kan också skräddarsys för olika mängder bladmaterial. Medan Abs och fusion proteiner taggade med GFP eller asGFP inte är avsedda att användas för terapier, dessa metoder kan vara användbara som kontroller under experiment och kan också ytterligare utnyttjas som ett pedagogiskt verktyg för molekylär och cellbiologi och bioteknik, både i-person och praktiskt taget.

Protocol

1. Odla N. benthamiana växter Placera jord torv pellets på en bricka och häll tidigare kokt, fortfarande varm (~ 40-45 °C), vatten över torv pellets för full expansion. Efter pellets är helt expanderade, placera 2-3 N. benthamiana frön på varje torv pellet med hjälp av pincett. Häll ca 0,5 i vatten för att täcka botten av facket. Märk brickan med sådatumet. Fortsätt att vattna plantorna dagligen med lämpliga mängder gödningsmedel. …

Representative Results

Denna studie visar en enkel och snabb metod för att producera rekombinanta proteiner och visualisera dem i hela nedströms processer. Med hjälp av N. benthamiana och efter det föreskrivna protokollet kan rekombinant proteinproduktion som beskrivs här uppnås på mindre än en vecka. Det övergripande arbetsflödet för växtuttryck, extraktion och rening visas i figur 1. Stadierna av växttillväxt från 2 veckor gamla plantor, 4 veckor gamla växter, och 6 veckor gamla växter …

Discussion

Detta protokoll kan utnyttjas för visuell verifiering av alla rekombinanta Ab eller rekombinant protein som produceras i N. benthamiana växter, inklusive de som kräver tillfällig exponering för sura miljöer för kolonnrening ändamål^42,43,44. Vidare kan sammansmältningen av asGFP till andra proteiner i olika uttryckssystem vara ett användbart verktyg för experimentell visualisering och utbildning. Protokollet …

Materials

5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182