JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Pesquisa do Câncer

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Published: October 02, 2020
doi:
10.3791/61775
, , , ,
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology,Western University, 3Department of Oncology,Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Dit experimentele protocol beschrijft de isolatie van BCSC’s uit borstkankercel- en weefselmonsters, evenals de in vitro pt in vivo assays die kunnen worden gebruikt om bcsc-fenotype en -functie te beoordelen.

Abstract

Borstkankerstamcellen (BCSC’s) zijn kankercellen met erfelijke of verworven stamcelachtige kenmerken. Ondanks hun lage frequentie leveren ze een belangrijke bijdrage aan borstkankerinitiatie, terugval, metastase en therapieresistentie. Het is noodzakelijk om de biologie van borstkankerstamcellen te begrijpen om nieuwe therapeutische doelen te identificeren voor de behandeling van borstkanker. Borstkankerstamcellen worden geïsoleerd en gekarakteriseerd op basis van expressie van unieke celoppervlakmarkers zoals CD44, CD24 en enzymatische activiteit van aldehydedehydrogenase (ALDH). Deze ALDHhogeCD44+CD24-cellen vormen de BCSC-populatie en kunnen worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor downstream functionele studies. Afhankelijk van de wetenschappelijke vraag kunnen verschillende in vitro pt in vivo methoden worden gebruikt om de functionele kenmerken van BCSC’s te beoordelen. Hier bieden we een gedetailleerd experimenteel protocol voor isolatie van menselijke BCSC’s uit zowel heterogene populaties van borstkankercellen als primair tumorweefsel verkregen van borstkankerpatiënten. Daarnaast belichten we downstream in vitro pt in vivo functionele assays, waaronder kolonievormende assays, mammosfeer assays, 3D-kweekmodellen en tumor xenograft assays die kunnen worden gebruikt om de BCSC-functie te beoordelen.

Introduction

Het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van menselijke borstkankerstamcellen (BCSC’s) is cruciaal voor het aanpakken van de uitdagingen die worden ondervonden bij de behandeling van borstkanker. De opkomst van het BCSC-concept dateert uit het begin van de21e eeuw, waar een kleine populatie CD44 + CD24– / lage borstkankercellen in staat bleek te zijn om heterogene tumoren bij muizen te genereren 1,2. Vervolgens werd waargenomen dat menselijke borstkankercellen met een hoge enzymatische activiteit van aldehydedehydrogenase (ALDHhoog) ook vergelijkbare stamcelachtige eigenschappen vertoonden3. Deze BCSC’s vertegenwoordigen een kleine populatie cellen die in staat zijn tot zelfvernieuwing en differentiatie, wat bijdraagt aan de heterogene aard van bulktumoren 1,2,3. Accumulerend bewijs suggereert dat veranderingen in evolutionair geconserveerde signaalroutes bcsc-overleving en -onderhoud stimuleren 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Bovendien is aangetoond dat de extrinsieke micro-omgeving van de cel een cruciale rol speelt bij het dicteren van verschillende BCSC-functies 15,16,17. Deze moleculaire routes en de externe factoren die de BCSC-functie reguleren, dragen bij aan de terugval van borstkanker, metastase18 en de ontwikkeling van resistentie tegen therapieën 19,20,21, waarbij het resterende bestaan van BCSC’s na de behandeling een grote uitdaging vormt voor de algehele overleving van borstkankerpatiënten 22,23 . Preklinische evaluatie van deze factoren is daarom erg belangrijk voor het identificeren van BCSC-gerichte therapieën die gunstig kunnen zijn voor het bereiken van betere behandelingsresultaten en een verbeterde algehele overleving bij borstkankerpatiënten.

Verschillende in vitro menselijke borstkanker cellijnmodellen en in vivo menselijke xenograftmodellen zijn gebruikt om BCSC’s 24,25,26,27,28,29 te karakteriseren. Het vermogen van cellijnen om continu opnieuw te bevolken na elke opeenvolgende passage maakt deze een ideaal modelsysteem om op omics gebaseerde en farmacogenomische studies uit te voeren. Cellijnen slagen er echter vaak niet in om de heterogeniteit die in patiëntenmonsters wordt waargenomen, samen te vatten. Daarom is het belangrijk om cellijngegevens aan te vullen met patiënt-afgeleide monsters. Isolatie van BCSC’s in hun zuiverste vorm is belangrijk voor het mogelijk maken van gedetailleerde karakterisering van BCSC’s. Het bereiken van deze zuiverheid hangt af van de selectie van fenotypische markers die specifiek zijn voor BCSC’s. Momenteel wordt het ALDHhogeCD44 + CD24-celfenotype het meest gebruikt om menselijke BCSC’s te onderscheiden en te isoleren van bulk borstkankercelpopulaties met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) voor maximale zuiverheid 1, 3,26. Bovendien kunnen de eigenschappen van geïsoleerde BCSC’s zoals zelfvernieuwing, proliferatie en differentiatie worden geëvalueerd met behulp van in vitro en in vivo technieken.

In vitro kolonievormende assays kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om het vermogen van een enkele cel om zichzelf te vernieuwen te beoordelen om een kolonie van 50 cellen of meer te vormen in aanwezigheid van verschillende behandelingsomstandigheden30. Mammosfeertests kunnen ook worden gebruikt om het zelfvernieuwingspotentieel van borstkankercellen onder verankeringsonafhankelijke omstandigheden te beoordelen. Deze test meet het vermogen van afzonderlijke cellen om te genereren en te groeien als bollen (mengsel van BCSC’s en niet-BCSC’s) bij elke opeenvolgende passage in serumvrije niet-adherente kweekomstandigheden31. Bovendien kunnen 3-dimensionale (3D) cultuurmodellen worden gebruikt om de BCSC-functie te beoordelen, inclusief cel-cel- en celmatrixinteracties die de in vivo micro-omgeving nauw samenvatten en onderzoek naar de activiteit van potentiële BCSC-gerichte therapieën mogelijk maken32. Ondanks de uiteenlopende toepassingen van in vitro modellen, is het moeilijk om de complexiteit van in vivo condities te modelleren met alleen in vitro assays. Deze uitdaging kan worden overwonnen door gebruik te maken van xenograftmodellen van muizen om BCSC-gedrag in vivo te evalueren. Dergelijke modellen dienen met name als een ideaal systeem voor het beoordelen van borstkankermetastase33, het onderzoeken van interacties met de micro-omgeving tijdens ziekteprogressie34, in vivo beeldvorming35, en voor het voorspellen van patiëntspecifieke toxiciteit en werkzaamheid van antitumormiddelen34.

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving voor de isolatie van menselijke ALDHhogeCD44 +CD24– BCSC’s met maximale zuiverheid uit bulkpopulaties van heterogene borstkankercellen. We geven ook een gedetailleerde beschrijving van drie in vitro technieken (kolonievormende assay, mammosfeertest en 3D-cultuurmodel) en een in vivo tumor xenograft-assay die kan worden gebruikt om verschillende functies van BCSC’s te beoordelen. Deze methoden zouden geschikt zijn voor gebruik door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het isoleren en karakteriseren van BCSC’s van menselijke borstkankercellijnen of van primaire patiënten afgeleide borstkankercellen en tumorweefsel met het oog op het begrijpen van BCSC-biologie en / of het onderzoeken van nieuwe BCSC-gerichte therapieën.

Protocol

Het verzamelen van patiënt-afgeleide chirurgische of biopsiemonsters rechtstreeks van instemmende borstkankerpatiënten werd uitgevoerd onder een goedgekeurd humaan ethisch protocol goedgekeurd door de institutionele ethische raad. Alle muizen die werden gebruikt om van de patiënt afgeleide xenograftmodellen te genereren, werden onderhouden en ondergebracht in een door de instelling goedgekeurde dierenfaciliteit. Het tumorweefsel van van de patiënt afgeleide xenograftmodellen met behulp van muizen werd gegenereerd vol…

Representative Results

Het beschreven protocol maakt isolatie van menselijke BCSC’s mogelijk van een heterogene populatie van borstkankercellen, hetzij uit cellijnen of uit gedissocieerd tumorweefsel. Voor een bepaalde cellijn of weefselmonster is het van cruciaal belang om een uniforme eencellige suspensie te genereren om BCSC’s met maximale zuiverheid te isoleren, aangezien het besmetten van niet-BCSC-populaties kan leiden tot variabele cellulaire reacties, vooral als het onderzoek tot doel heeft de werkzaamheid van therapeutische middelen g…

Discussion

Borstkankermetastase en resistentie tegen therapie zijn wereldwijd belangrijke doodsoorzaken bij vrouwen geworden. Het bestaan van een subpopulatie van borstkankerstamcellen (BCSC’s) draagt bij aan verbeterde metastase 26,43,44,45,46 en therapieresistentie 21,47,48. …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken de leden van ons laboratorium voor hun nuttige discussies en steun. Ons onderzoek naar borstkankerstamcellen en de tumormicro-omgeving wordt gefinancierd door subsidies van het Canadian Cancer Research Society Research Institute en het U.S. Army Department of Defense Breast Cancer Program (Grant # BC160912). V.B. wordt ondersteund door een Western Postdoctoral Fellowship (Western University), en zowel A.L.A. als V.B. worden ondersteund door de Breast Cancer Society of Canada. C.L. wordt ondersteund door een Vanier Canada Graduate Scholarship van de Canadese overheid.

Materials

7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1×106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  2. Shipitsin, M., et al. Molecular definition of breast tumor heterogeneity. Cancer Cell. 11 (3), 259-273 (2007).
  3. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  4. Sulaiman, A., et al. Dual inhibition of Wnt and Yes-associated protein signaling retards the growth of triple-negative breast cancer in both mesenchymal and epithelial states. Molecular Oncology. 12 (4), 423-440 (2018).
  5. Debeb, B. G., et al. Histone deacetylase inhibitors stimulate dedifferentiation of human breast cancer cells through WNT/β-catenin signaling. Stem Cells. 30 (11), 2366-2377 (2012).
  6. Klutzny, S., et al. PDE5 inhibition eliminates cancer stem cells via induction of PKA signaling. Cell Death & Disease. 9 (2), 192 (2018).
  7. DiMeo, T. A., et al. A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Pesquisa do Câncer. 69 (13), 5364-5373 (2009).
  8. Liu, C. C., Prior, J., Piwnica-Worms, D., Bu, G. LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (11), 5136-5141 (2010).
  9. Miller-Kleinhenz, J., et al. Dual-targeting Wnt and uPA receptors using peptide conjugated ultra-small nanoparticle drug carriers inhibited cancer stem-cell phenotype in chemo-resistant breast cancer. Biomaterials. 152, 47-62 (2018).
  10. Mamaeva, V., et al. Inhibiting Notch Activity in Breast Cancer Stem Cells by Glucose Functionalized Nanoparticles Carrying γ-secretase Inhibitors. Molecular Therapy. 24 (5), 926-936 (2016).
  11. Ithimakin, S., et al. HER2 drives luminal breast cancer stem cells in the absence of HER2 amplification: implications for efficacy of adjuvant trastuzumab. Pesquisa do Câncer. 73 (5), 1635-1646 (2013).
  12. Koike, Y., et al. Anti-cell growth and anti-cancer stem cell activities of the non-canonical hedgehog inhibitor GANT61 in triple-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 24 (5), 683-693 (2017).
  13. Sun, Y., et al. Estrogen promotes stemness and invasiveness of ER-positive breast cancer cells through Gli1 activation. Molecular Cancer. 13, 137 (2014).
  14. Colavito, S. A., Zou, M. R., Yan, Q., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) expression in claudin-low breast cancer and crosstalk with the nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB) pathway. Breast Cancer Research. 16 (5), 444 (2014).
  15. Bhat, V., Allan, A. L., Raouf, A. Role of the Microenvironment in Regulating Normal and Cancer Stem Cell Activity: Implications for Breast Cancer Progression and Therapy Response. Cancers. 11 (9), (2019).
  16. Pio, G. M., Xia, Y., Piaseczny, M. M., Chu, J. E., Allan, A. L. Soluble bone-derived osteopontin promotes migration and stem-like behavior of breast cancer cells. PloS One. 12 (5), 0177640 (2017).
  17. Chu, J. E., et al. Lung-derived factors mediate breast cancer cell migration through CD44 receptor-ligand interactions in a novel ex vivo system for analysis of organ-specific soluble proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-191 (2014).
  18. McGowan, P. M., et al. Notch1 inhibition alters the CD44hi/CD24lo population and reduces the formation of brain metastases from breast cancer. Molecular Cancer Research. 9 (7), 834-844 (2011).
  19. Mao, J., et al. ShRNA targeting Notch1 sensitizes breast cancer stem cell to paclitaxel. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (6), 1064-1073 (2013).
  20. Duru, N., et al. HER2-associated radioresistance of breast cancer stem cells isolated from HER2-negative breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6634-6647 (2012).
  21. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  22. Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13820-13825 (2009).
  23. Calcagno, A. M., et al. Prolonged drug selection of breast cancer cells and enrichment of cancer stem cell characteristics. Journal of the National Cancer Institute. 102 (21), 1637-1652 (2010).
  24. Feng, Y., et al. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis. 5 (2), 77-106 (2018).
  25. Samanta, D., Gilkes, D. M., Chaturvedi, P., Xiang, L., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors are required for chemotherapy resistance of breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5429-5438 (2014).
  26. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8), 2236-2252 (2009).
  27. Morel, A. P., et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PloS One. 3 (8), 2888 (2008).
  28. Muntimadugu, E., Kumar, R., Saladi, S., Rafeeqi, T. A., Khan, W. CD44 targeted chemotherapy for co-eradication of breast cancer stem cells and cancer cells using polymeric nanoparticles of salinomycin and paclitaxel. Colloids Surf B Biointerfaces. 143, 532-546 (2016).
  29. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  30. Munshi, A., Hobbs, M., Meyn, R. E. Clonogenic cell survival assay. Methods in Molecular Medicine. 110, 21-28 (2005).
  31. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  32. Shin, C. S., Kwak, B., Han, B., Park, K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Molecular Pharmaceutics. 10 (6), 2167-2175 (2013).
  33. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  34. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse models of cancer. Annual Review of Pathology. 6, 95-119 (2011).
  35. Lyons, S. K. Advances in imaging mouse tumour models in vivo. Journal of Pathology. 205 (2), 194-205 (2005).
  36. Margaryan, N. V., et al. The Stem Cell Phenotype of Aggressive Breast Cancer Cells. Cancers. 11 (3), (2019).
  37. Ma, F., et al. Enriched CD44(+)/CD24(-) population drives the aggressive phenotypes presented in triple-negative breast cancer (TNBC). Cancer Letters. 353 (2), 153-159 (2014).
  38. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER(+) Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388-401 (2019).
  39. Phan-Lai, V., et al. Three-dimensional scaffolds to evaluate tumor associated fibroblast-mediated suppression of breast tumor specific T cells. Biomacromolecules. 14 (5), 1330-1337 (2013).
  40. O’Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
  41. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  42. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  43. Abraham, B. K., et al. Prevalence of CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis. Clinical Cancer Research. 11 (3), 1154-1159 (2005).
  44. Balic, M., et al. Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype. Clinical Cancer Research. 12 (19), 5615-5621 (2006).
  45. Charafe-Jauffret, E., et al. Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (1), 45-55 (2010).
  46. Marcato, P., et al. Aldehyde dehydrogenase activity of breast cancer stem cells is primarily due to isoform ALDH1A3 and its expression is predictive of metastasis. Stem Cells. 29 (1), 32-45 (2011).
  47. Lacerda, L., Pusztai, L., Woodward, W. A. The role of tumor initiating cells in drug resistance of breast cancer: Implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 13 (4-5), 99-108 (2010).
  48. Liu, S., Wicha, M. S. Targeting breast cancer stem cells. Journal of Clinical Oncology. 28 (25), 4006-4012 (2010).
  49. D’Angelo, R. C., et al. Notch reporter activity in breast cancer cell lines identifies a subset of cells with stem cell activity. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (3), 779-787 (2015).
  50. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  51. Forozan, F., et al. Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data. Pesquisa do Câncer. 60 (16), 4519-4525 (2000).
  52. Lanier, L. L. Just the FACS. Journal of Immunology. 193 (5), 2043-2044 (2014).
  53. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 19-39 (2007).
  54. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  55. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  56. Sun, C., et al. Immunomagnetic separation of tumor initiating cells by screening two surface markers. Scientific Reports. 7, 40632 (2017).
  57. Rodríguez, C. E., et al. Breast cancer stem cells are involved in Trastuzumab resistance through the HER2 modulation in 3D culture. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (2), 1381-1391 (2018).
  58. Kim, D. W., Cho, J. Y. NQO1 is Required for β-Lapachone-Mediated Downregulation of Breast-Cancer Stem-Cell Activity. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), (2018).
  59. Xu, L. Z., et al. p62/SQSTM1 enhances breast cancer stem-like properties by stabilizing MYC mRNA. Oncogene. 36 (3), 304-317 (2017).
  60. Huang, X., et al. Breast cancer stem cell selectivity of synthetic nanomolar-active salinomycin analogs. BMC Cancer. 16, 145 (2016).
  61. Liu, T. J., et al. CD133+ cells with cancer stem cell characteristics associates with vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer. Oncogene. 32 (5), 544-553 (2013).
  62. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Pesquisa do Câncer. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  63. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  64. Palomeras, S., Ruiz-Martínez, S., Puig, T. Targeting Breast Cancer Stem Cells to Overcome Treatment Resistance. Molecules. 23 (9), (2018).
  65. McClements, L., et al. Targeting treatment-resistant breast cancer stem cells with FKBPL and its peptide derivative, AD-01, via the CD44 pathway. Clinical Cancer Research. 19 (14), 3881-3893 (2013).
  66. Berger, D. P., Henss, H., Winterhalter, B. R., Fiebig, H. H. The clonogenic assay with human tumor xenografts: evaluation, predictive value and application for drug screening. Annals of Oncology. 1 (5), 333-341 (1990).
  67. Tian, J., et al. Dasatinib sensitises triple negative breast cancer cells to chemotherapy by targeting breast cancer stem cells. British Journal of Cancer. 119 (12), 1495-1507 (2018).
  68. Samoszuk, M., Tan, J., Chorn, G. Clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured in direct contact with serum-activated fibroblasts. Breast Cancer Research. 7 (3), 274-283 (2005).
  69. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  70. Xu, Y., Hu, Y. D., Zhou, J., Zhang, M. H. Establishing a lung cancer stem cell culture using autologous intratumoral fibroblasts as feeder cells. Cell Biology International. 35 (5), 509-517 (2011).
  71. Palmieri, C., et al. Fibroblast growth factor 7, secreted by breast fibroblasts, is an interleukin-1beta-induced paracrine growth factor for human breast cells. Journal of Endocrinology. 177 (1), 65-81 (2003).
  72. Bourguignon, L. Y., Peyrollier, K., Xia, W., Gilad, E. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (25), 17635-17651 (2008).
  73. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  74. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  75. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  76. Okano, M., et al. Orthotopic Implantation Achieves Better Engraftment and Faster Growth Than Subcutaneous Implantation in Breast Cancer Patient-Derived Xenografts. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  77. Zhang, Y., et al. Establishment of a murine breast tumor model by subcutaneous or orthotopic implantation. Oncology Letters. 15 (5), 6233-6240 (2018).
  78. Zhang, W., et al. Comparative Study of Subcutaneous and Orthotopic Mouse Models of Prostate Cancer: Vascular Perfusion, Vasculature Density, Hypoxic Burden and BB2r-Targeting Efficacy. Scientific Reports. 9 (1), 11117 (2019).
  79. Kim, R., Emi, M., Tanabe, K. Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology. 121 (1), 1-14 (2007).
  80. Rosato, R. R., et al. Evaluation of anti-PD-1-based therapy against triple-negative breast cancer patient-derived xenograft tumors engrafted in humanized mouse models. Breast Cancer Research. 20 (1), 108 (2018).
  81. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 99 (2018).
  82. Meraz, I. M., et al. An Improved Patient-Derived Xenograft Humanized Mouse Model for Evaluation of Lung Cancer Immune Responses. Cancer Immunol Res. 7 (8), 1267-1279 (2019).
  83. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. Biodrugs. 32 (3), 245-266 (2018).

Tags

Keywords: Breast Cancer Stem CellsCell IsolationSingle Cell SuspensionALDH AssayColony Forming AssayFunctional CharacterizationTumorigenicityMetastasis
check_url/pt/61775?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image