Protocole d’immunohistochimie et de distribution in situ de l’ARN au sein de l’embryon précoce de drosophile
Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour la détection et la localisation de la protéine embryonnaire et de l’ARN de la drosophile , de la collecte à la pré-intégration et à l’intégration, à l’immunocoloration et à l’hybridation in situ de l’ARNm.
Abstract
La signalisation de libération de calcium induite par le calcium (CICR) joue un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques. Toutes les activités cellulaires, de la prolifération cellulaire et de l’apoptose, du développement et du vieillissement, à la plasticité synaptique neuronale et à la régénération, ont été associées aux récepteurs de la ryanodine (RyRs). Malgré l’importance de la signalisation calcique, le mécanisme exact de sa fonction au début du développement n’est pas clair. En tant qu’organisme à courte période gestationnelle, les embryons de Drosophila melanogaster sont des sujets d’étude de premier ordre pour étudier la distribution et la localisation des protéines associées au CICR et de leurs régulateurs au cours du développement. Cependant, en raison de leurs embryons riches en lipides et de leur chorion riche en chitine, leur utilité est limitée par la difficulté de monter des embryons sur des surfaces en verre. Dans ce travail, nous introduisons un protocole pratique qui améliore considérablement l’attachement de l’embryon de drosophile sur des lames et des méthodes détaillées pour une histochimie, une immunohistochimie et une hybridation in situ réussies. La méthode de revêtement de lame de gélatine d’alun chromé et la méthode de pré-intégration d’embryons augmentent considérablement le rendement dans l’étude de la protéine embryonnaire de drosophile et de l’expression de l’ARN. Pour démontrer cette approche, nous avons étudié DmFKBP12 / Calstabin, un régulateur bien connu de RyR au début du développement embryonnaire de Drosophila melanogaster. Nous avons identifié DmFKBP12 dès le stade syncytial du blastoderme et rapporté le schéma d’expression dynamique de DmFKBP12 au cours du développement: d’abord en tant que protéine uniformément distribuée dans le blastoderme syncytial, puis en se localisant préalablement dans la couche inférieure du cortex pendant le blastoderme cellulaire, avant de se distribuer dans l’architecture neuronale primitive et de digestion pendant la phase à trois couches gemmes au début de la gastrulation. Cette distribution peut expliquer le rôle essentiel que joue RyR dans les systèmes d’organes vitaux qui proviennent de ces couches: le ganglion sous-œsophagien et supra-œsophagien, le système nerveux ventral et le système musculo-squelettique.
Introduction
La signalisation de libération de calcium induite par le calcium (CICR) joue un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques, tels que la fonction vasculaire squelettique / lisse et cardiaque, la prolifération cellulaire et l’apoptose, le développement, le vieillissement, la plasticité synaptique neuronale et la régénération1,2,3,4,5,6 . Les récepteurs de la ryanodine (RyRs) et les récepteurs de l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3R) sont des acteurs majeurs de la voie de signalisation du calcium contrôlée par leurs régulateurs la protéine kinase A (PKA), la protéine kinase II dépendante de la Ca2+/calmoduline (CaMKII), les protéines de liaison FK506 (FKBPs), la calséquestrine (CSQ), la triadine et la junctine1,2,3,4,5,6 . Une expression humaine anormale et des mutations dans ces protéines peuvent entraîner une physiologie pathologique telle que des arythmies7 et une prolifération oncogène8,9.
Les FKBPs régulent la libération de calcium par le réticulaire endoplasmique (RE) par les RyRs. Ce processus est essentiel pour le mécanisme de contraction, et donc responsable de tout mouvement mécanique généré par la contraction de la myosine-actine par la libération de calcium induite par le calcium avec les RyRs1,2 embryonnaires. Dans les modèles murins, l’absence de RyR2 et de son régulateur FKBP12/Calstabin est invariablement mortelle, que ce soit pendant le développement embryonnaire ou au début de la période postnatale10,11,12. Les souris knock-out FKBP12/Calstabin présentent des malformations cardiaques critiques avec couplage excitation-contraction (EC) irrégulier et œdème cérébral au cours du développement embryonnaire. Cela indique que FKBP12/Calstabin joue un rôle essentiel dans la régulation de l’expression du canal RyR2, ce qui est important à la fois pour le développement cardiaque et cérébral10.
Des étincelles de calcium menées par RyR ont été initialement découvertes dans la phase de formation de zygotes d’œufs de Medaka fécondés13,14. Cependant, peu d’études ont été effectuées sur la fonction de la signalisation du calcium au début du développement embryonnaire. Chez Drosophila melanogaster, les résultats obtenus à partir de mutants DmFKBP12 S107 fournissent des preuves solides soutenant l’importance de ce gène pour le développement larvaire et une durée de vie saine, ce qui est attribué à sa fonction contre le stress oxydatif15,16. Récemment, nous avons identifié la localisation dynamique de la protéine FKBP12/Calstabin et de l’ARN messager au début du développement de Drosophila melanogaster17. En utilisant les approches décrites dans cette méthodologie, nous avons pu suivre l’expression de FKBP12/Calstabin chez D. melanogaster pendant le blastoderme syncytial (0-2 h), le blastoderme cellulaire (2-3 h), la gastrula précoce (3-12 h) et la gastrula tardive (12-24 h). Dans cet article, nous présentons les protocoles détaillés de chaque approche de l’étude précédente, y compris l’incorporation pré-embryonnaire pour la section classique de paraffine, le traitement de lame pré-revêtement pour les sections embryonnaires, la coloration histo-chimique et l’immunocoloration, et l’hybridation in situ de l’ARNm pour l’identification de l’expression génique.
Protocol
Representative Results
Discussion
La signalisation calcique médiée par les RyRs et les IP3R est une voie fondamentale dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques des animaux vertébrés et invertébrés1,2,3,4. Chez l’homme, des mutations ponctuelles, telles que la mutation R4496C associée à la CPVT, dans le gène RyR2 entraînent une fuite de calcium du réticulum sarcoplasmique du cardiomyocyte, entraîna…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (#31771377 / 31571273 / 31371256), le programme de scientifique distingué étranger du ministère national de l’Éducation (#MS2014SXSF038), le Fonds de recherche des universités centrales du ministère national de l’Éducation (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45), et XZ est soutenu par le Fonds de thèse de doctorat exceptionnelle (#2019TS082 / 2019TS079), le programme clé du département de l’éducation provinciale du Shaanxi (#20JS138), le projet jeunesse du programme de recherche fondamentale en sciences naturelles du département provincial des sciences et de la technologie du Shaanxi (#2020JQ-885).
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
Referências
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