Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo de detecção e localização da proteína de embrião Drosophila e RNA da coleta à pré-incorporação e incorporação, imunostaining e mRNA in situ hibridização.

Resumo

A sinalização de liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR) desempenha um papel crítico em muitos processos biológicos. Toda atividade celular desde a proliferação celular e apoptose, desenvolvimento e envelhecimento, até a plasticidade sináptica neuronal e a regeneração têm sido associadas aos receptores ryanodo (RyRs). Apesar da importância da sinalização de cálcio, o mecanismo exato de sua função no desenvolvimento precoce não é claro. Como um organismo com um curto período gestacional, os embriões de Drosophila melanogaster são temas de estudo primordial para investigar a distribuição e localização de proteínas associadas ao CICR e seus reguladores durante o desenvolvimento. No entanto, devido aos seus embriões ricos em lipídios e corão rica em quitina, sua utilidade é limitada pela dificuldade de montar embriões em superfícies de vidro. Neste trabalho, introduzimos um protocolo prático que aumenta significativamente a fixação do embrião Drosophila em slides e métodos de detalhes para histoquímica bem sucedida, imunohistoquímica e hibridização in situ . O método de revestimento de slides de gelatina cromada e o método de pré-incorporação de embriões aumentam drasticamente o rendimento no estudo da proteína embrião Drosophila e da expressão de RNA. Para demonstrar essa abordagem, estudamos o DmFKBP12/Calstabin, um conhecido regulador do RyR durante o desenvolvimento embrionário precoce do Drosophila melanogaster. Identificamos o DmFKBP12 no estágio de blastoderme sinintítico e relatamos o padrão de expressão dinâmica do DmFKBP12 durante o desenvolvimento: inicialmente como uma proteína distribuída uniformemente na blastodermia sincicial, localizando preliminarmente a camada de porão do córtex durante o blastoderm celular, antes de distribuir na arquitetura neuronal e digestão primitiva durante a fase de três gemas no início da gasolação. Essa distribuição pode explicar o papel crítico que o RyR desempenha nos sistemas vitais de órgãos que se originam a partir dessas camadas: o gânglio suboesofágico e supraesofágico, o sistema nervoso ventral e o sistema musculoesquelético.

Introdução

A sinalização de liberação de cálcio (CICR) tem papel crítico em muitos processos biológicos, como músculo esquelético/liso e função vascular cardíaca, proliferação celular e apoptose, desenvolvimento, envelhecimento, plasticidade sináptica neuronal e regeneração1,2,3,4,5,6 . Os receptores ryanodine (RyRs) e os receptores de linfosfato inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3Rs) são os principais players na via de sinalização de cálcio controlada por seus reguladores protein quinas....

Protocolo

1. Preparação de pratos de ágar de suco de uva

1. Adicione 5 g de ágar e 5 g de sacarose a 150 mL de água destilada. Ferva-o usando um micro-ondas até que o ágar e a sacarose estejam totalmente dissolvidos. Misture 50 mL de suco de uva 100% e a solução em conjunto.
2. Adicione 1 mL de ácido 100% propiônico para fazer a concentração final a 0,5% de ácido propínico. Despeje 25 mL da solução preparada em cada placa. Depois que o ágar se solidificar, armazene a mídia em 4 °C.

2. Slides de revestimento

1. Deslizes pré-tratados com detergente. Lave os slides 3 vezes com água da torneira....

Resultados

As figuras descrevem protocolos usados para superar o desafio de anexar embriões de chorão de alta lipídica e de chitina (Tabela 1) à superfície do slide de vidro para exame e experimentação. Utilizando o método de revestimento de slides de gelatina cromada mostrado na Figura 1, aumentamos a fixação de embriões de Drosophila na superfície dos slides, enquanto o método de pré-incorporação de embriões mostrado na Figura 2 permite.......

Discussão

RyRs e IP3Rs mediados sinalização de cálcio é um caminho fundamental em muitos processos fisiológicos e patológicos de animais vertebrados e invertebrados1,2,3,4. Em humanos, mutações pontuais, como a mutação R4496C associada ao CPVT, no gene RyR2 levam ao vazamento de cálcio do ritúlumo sarcoplasmático do cardiomiócito, resultando em disfunção cardíaca. Essas mutações apresentam-se como arritm.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
-20° C Frigorífico	Meiling Biologia & Médico	DW-YL270	Usado para armazenamento regente-80
° C Refrigerador de temperatura ultra baixa		Thermo Forma 90	Series Usado para armazenamento de regentes
Ágar	Sigma-Aldrich	WXBB6360V	Preparação de placas de ágar suco de uva
Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos de Fab	Roche	11093274910	Para a detecção de composto marcado com digoxigenina
Incubadora bioquímica	Shanghai Bluepard Instruments	LRH-250	In-situ Hibridização
Solução de Bouin	Reagente Químico Sinopharm em Pequim	69945460	Drosophila Centrífuga de Incorporação de Embriões
	Eppendorf	540BH07808	In-situ Tubo
Centrífuga	Denville	C-2170	Coleção de Embriões de Drosophila
Reagente Químico Sinopharm de Alum de Cromo	em Lâminas	revestimento	de 10001018
Banho-maria de temperatura constante	Jintan Henfeng Instruments	KW-1000DC	Coloração de hematoxilina-eosina, imuno-histoquímica, hibridização in-situ e coloração de metenamina de ácido periódico-prata
Dako REAL EnVision Sistema de detecção	Dako	K5007	Na reação imuno-histoquímica ou reação de hibridização in situ, ele se liga ao anticorpo antígeno primário e o alvo é marcado por coloração.
DIG de hibridização in-situ	DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
RNA	11093274910	Roche	com diagoxigenina-UTP por transcrição in vitro com RNA polimerase SP6 e T7
Drosophila melanogaster	Bloomington Stock Center	BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664	Os estoques de Drosophila melanogaster mutante
Forno elétrico de secagem por explosão	Tianjin Taiste Instruments	101-0AB	Para revestimento de lâminas e incorporação de parafina
Eosin	Sigma-Aldrich	230251	Coloração de Hematoxilina-Eosina
	Reagente Químico de Sinopharm de Etanol em Pequim	100092680	Incorporação de Parafina, Coloração de Hematoxilina-Eosina, Imuno-histoquímica, Hibridização In-situ e Coloração
de Ácido Periódico-Prata MetenaminaReagente químico de gelatina	Sinopharm em lâminas	de revestimento	de 10010328
Cloreto de ouro	Sigma-Aldrich	379948	Coloração de metenamina de ácido periódico-prata
Hematoxilina	Sigma-Aldrich	H3136	Coloração de hematoxilina-eosina
Kit de purificação de produto de PCR de alta pureza Roche		11732668001	Para purificação de produtos
de PCRCaixa inteligente de temperatura e umidade constante	Ningbo Jiangnan Instruments	HWS	para manutenção de moscas
LE Agarose	HyAgarose	14190108029	Reagente químico pré-incorporado de
metanol	Sinopharm em Pequim	10014108	Microscópio de coleta de embriões Drosophila
	ZEISS	Observer.A1	Coloração de hematoxilina-eosina, imuno-histoquímica, hibridização in-situ e coloração de metenamina de ácido periódico-prata
Lâminas de microscópio	MeVid Labware Manufacturing	P105-2001	Lâminas de revestimento
goma neutra	Sinopharm em Pequim	10004160	Coloração de hematoxilina-eosina
N-heptano	Sinopharm em Pequim	40026768	Embrião de Drosophila Coleção
Cortador de parafina	Huahai instrumento científico	HH-2508III	em>In-situ Reagente químico de parafina de hibridização
	Sinopharm em Pequim	69019461	Medidor
pH / mV	Sartorius	PB-10	Para determinar o valor de pH de uma solução
Reagente químico Sinopharm	nitrato de prata		de coloração de metenamina de ácido periódico-prata
	Thermo	AFXI-0501-P	In-situ
xileno	Sinopharm	10023418	incorporação de parafina

de de Hibridização de de PequimKit de marcação de RNA Marcação de da de PequimReagente químico deReagente químico< de de incorporação de parafina de na 10018461 de Pequim Medidor de água ultrapuro Reagente químico de de hibridização em Pequim