Un protocolo para la inmunohistoquímica y la distribución in situ de ARN dentro del embrión temprano de Drosophila
Summary
Aquí, describimos un protocolo para la detección y localización de la proteína embrionaria de Drosophila y el ARN desde la recolección hasta la preincrustación e incrustación, la inmunotinción y la hibridación in situ de ARNm.
Abstract
La señalización de liberación de calcio inducida por calcio (CICR) juega un papel crítico en muchos procesos biológicos. Todas las actividades celulares, desde la proliferación celular y la apoptosis, el desarrollo y el envejecimiento, hasta la plasticidad sináptica neuronal y la regeneración, se han asociado con los receptores de rianodina (RyR). A pesar de la importancia de la señalización del calcio, el mecanismo exacto de su función en el desarrollo temprano no está claro. Como organismo con un período gestacional corto, los embriones de Drosophila melanogaster son sujetos de estudio principales para investigar la distribución y localización de las proteínas asociadas a CICR y sus reguladores durante el desarrollo. Sin embargo, debido a sus embriones ricos en lípidos y corion rico en quitina, su utilidad está limitada por la dificultad de montar embriones en superficies de vidrio. En este trabajo, presentamos un protocolo práctico que mejora significativamente la unión del embrión de Drosophila en diapositivas y detallamos los métodos para una histoquímica, inmunohistoquímica e hibridación in situ exitosas. El método de recubrimiento deslizante de gelatina de alumbre de cromo y el método de preincrustación de embriones aumenta drásticamente el rendimiento en el estudio de la proteína embrionaria de Drosophila y la expresión de ARN. Para demostrar este enfoque, estudiamos DmFKBP12/Calstabina, un conocido regulador de RyR durante el desarrollo embrionario temprano de Drosophila melanogaster. Identificamos DmFKBP12 ya en la etapa de blastodermo sincitial e informamos el patrón de expresión dinámica de DmFKBP12 durante el desarrollo: inicialmente como una proteína distribuida uniformemente en el blastodermo sincitial, luego localizando preliminarmente en la capa basal de la corteza durante el blastodermo celular, antes de distribuirse en la arquitectura neuronal y de digestión primitiva durante la fase de la capa de tres gemas en la gastrulación temprana. Esta distribución puede explicar el papel crítico que desempeña RyR en los sistemas de órganos vitales que se originan en estas capas: el ganglio suboesofágico y supraesofágico, el sistema nervioso ventral y el sistema musculoesquelético.
Introduction
La señalización de liberación de calcio inducida por calcio (CICR) desempeña un papel fundamental en muchos procesos biológicos, como el músculo esquelético/liso y la función vascular cardíaca, la proliferación celular y la apoptosis, el desarrollo, el envejecimiento, la plasticidad sináptica neuronal y la regeneración1,2,3,4,5,6 . Los receptores de rianodina (RyR) y los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) son actores importantes en la vía de señalización del calcio controlada por sus reguladores proteína quinasa A (PKA), proteína quinasa II dependiente de Ca2+ / calmodulina (CaMKII), proteínas de unión a FK506 (FKBP), calsequestrina (CSQ), triadina y junctina1,2,3,4,5,6 . La expresión humana anormal y las mutaciones en estas proteínas pueden conducir a fisiología patológica como arritmias7 y proliferación oncogénica8,9.
Los FKBP regulan la liberación de calcio del reticular endoplásmico (RE) por los RyRs. Este proceso es esencial para el mecanismo de contracción y, por lo tanto, responsable de todo el movimiento mecánico generado por la contracción de miosina-actina a través de la liberación de calcio inducida por calcio junto con los RyR embrionarios1,2. En modelos de ratón, la falta de RyR2 y su regulador FKBP12/Calstabina es invariablemente letal, ya sea durante el desarrollo embrionario o en el período postnatal temprano10,11,12. Los ratones knockout FKBP12/Calstabin exhiben defectos cardíacos críticos con acoplamiento irregular excitación-contracción (CE) y edema cerebral durante el desarrollo embrionario. Esto indica que FKBP12/Calstabina juega un papel esencial en la regulación de la expresión del canal RyR2, que es importante tanto para el desarrollo cardíaco como cerebral10.
Las chispas de calcio conducidas por RyR se descubrieron inicialmente en la fase de formación de cigotos de los huevos de Medaka fertilizados13,14. Sin embargo, se han realizado pocas investigaciones sobre la función de la señalización del calcio en el desarrollo embrionario temprano. En Drosophila melanogaster, los resultados obtenidos de los mutantes DmFKBP12 S107 proporcionan una fuerte evidencia que respalda la importancia de este gen para el desarrollo larvario y una vida saludable, lo que se atribuye a su función contra el estrés oxidativo15,16. Recientemente, identificamos la localización dinámica de la proteína FKBP12/Calstabina y el ARN mensajero durante el desarrollo temprano de Drosophila melanogaster17. Utilizando los enfoques descritos en esta metodología, pudimos rastrear la expresión de FKBP12/Calstabina en D. melanogaster durante el blastodermo sincitial (0-2 h), blastodermo celular (2-3 h), gastrula temprana (3-12 h) y gastrula tardía (12-24 h). En este artículo, presentamos los protocolos detallados de cada enfoque en el estudio anterior, incluida la incrustación preembrionaria para la sección clásica de parafina, el tratamiento con diapositivas de pre-recubrimiento para secciones embrionarias, la tinción histoquímica y la inmunotinción, y la hibridación in situ de ARNm para la identificación de la expresión génica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La señalización de calcio mediada por RyRs e IP3Rs es una vía fundamental en muchos procesos fisiológicos y patológicos de animales vertebrados e invertebrados1,2,3,4. En humanos, las mutaciones puntuales, como la mutación R4496C asociada a CPVT, en el gen RyR2 conducen a la fuga de calcio del retículo sarcoplásmico del cardiomiocito, lo que resulta en disfunción cardíaca. Estas mutac…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (# 31771377 / 31571273 / 31371256), el Programa de Científicos Distinguidos Extranjeros del Departamento Nacional de Educación (#MS2014SXSF038), el Fondo de Investigación de universidades centrales del Departamento Nacional de Educación (#GK201301001/201701005 / GERP-17-45), y XZ cuenta con el apoyo del Fondo de Tesis Doctoral Sobresaliente (#2019TS082 / 2019TS079), Programa Clave del Departamento de Educación Provincial de Shaanxi (#20JS138), el Proyecto Juvenil del Programa de Investigación Básica en Ciencias Naturales del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Shaanxi (#2020JQ-885).
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
Referências
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
- Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
- Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
- George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
- Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
- Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
- Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
- Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
- Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
- Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
- Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
- Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
- Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the ‘resolution revolution’. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).
