지질 결합 단백질및 알레르겐에서 내인성 리간드의 제거 및 교체
Summary
이 프로토콜은 알레르겐에서 내인성 지질의 제거를 설명하고, 열 어닐링과 결합 된 역단계 HPLC를 통해 사용자 지정 리간드로 교체. 31 P-NMR 및 원형 이크로이즘은 리간드 제거/로딩의 신속한 확인과 토착 알레르겐 구조의 회복을 허용한다.
Abstract
많은 주요 알레르겐은 Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 및 Fel d 1을 포함하여 소수성 지질과 같은 분자에 결합합니다. 이러한 리간드는 강하게 유지되며 면역 체계를 직접 자극하거나 알레르기 성 단백질의 생물 학적 특성을 변경하여 감쇠 과정에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이러한 변수를 제어하기 위해서는 내인성 바운드 리간드를 제거하고 필요한 경우 알려진 조성물의 지질을 대체하는 데 기술이 필요합니다. 바퀴벌레 알레르겐 블라 g 1은 전통적인 기술을 사용하여 정제 할 때 내생 지질의 이질적 혼합물을 결합하는 큰 소수성 구멍을 둘러싸고 있습니다. 여기서는 역상 HPLC를 사용하여 이러한 지질을 제거한 다음 열 어닐링으로 아포 형태로 Bla g 1을 산출하거나 지방산 또는 인지질화물의 사용자 정의 혼합물로 재장전되는 방법을 설명합니다. 생화학적 분석과 이 프로토콜을 결합하면 지방산 화물이 Bla g 1의 열안정성 및 보철 저항을 크게 변화시키고 T 세포 에피토프 생성 및 알레르기성 속도에 대한 하류에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 재조합 및 천연 소스 모두에서 알레르겐을 연구할 때 본원에 설명된 것과 같은 지질 제거/재장전 프로토콜의 중요성을 강조한다. 이 프로토콜은 리포칼린(Mus m 1), PR-10(Bet v 1), MD-2(Der p 2) 및 우트로글로빈(Fel d 1)을 포함한 다른 알레르겐 가족에게 일반화되어 알레르기 반응에서 지질의 역할을 연구하는 귀중한 도구를 제공한다.
Introduction
알레르겐 데이터베이스를 조사한 결과 알레르겐은 알려진 모든 단백질 가족의 2%만에서 발견되는 것으로 나타났으며, 이는 일반적인 기능성 및 생체학적 특성이 알레르기성1에기여한다는 것을 시사한다. 이러한 특성 중, 지질 화물을 결합하는 능력은 알러지 원 들 사이에서 강하게 과대 대표되는 것으로 보이며, 이러한 화물이 민감화 과정1에영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 실제로, 브라질 너트 알레르겐 Ber e 1은 내인성 지질과 함께 완전한 감이 있는 잠재력2를실현하는 데 협력해야 한다는 것을 보여주었습니다. 이들 지질은 잠재적으로 mite 알레르겐 Der p 2 및 Der p 7에 의해 도시된 바와 같이 면역 체계를 자극할 수 있으며, 둘 다 LPS 결합 단백질3,4,5와함께 강한 구조적 동성학을 공유할 수 있다. 이러한 관찰에 기초하여 Derp 2 및 Der p 7은 세균지질을 결합하고 TLR4 매개 신호를 통해 숙주 면역 체계를 직접 자극하여 민감화 과정5,6을용이하게 할 수 있다고 제안되었다. 내인성 으로 결합된 지질이 알레르기 성 단백질 자체의 생물학적 특성을 바꿀 수 있습니다. 예를 들어, 신a2(겨자) 및 아라 h1(땅콩)이 인지질 소포와 상호작용하는 능력은 위 및 내외 저하7에대한 저항력을 크게 향상시켰으며, 주요 자작나무 꽃가루 알러지 유발 물질 내기 v 1에 결합하는 동안 내구 처리속도와 결과 펩타이드의 다양성을 모두 변화시켰다8. 이는 Bet v 1 및 Bla g 1과 같은 단백질에 대한 안정성, T 세포 에피토프 생성 및 알레르기성 사이에서 관찰된 상관관계를 고려하여 알레르기성과 특히 관련이 있습니다. 후자는 이 작품의 주제가 될 것입니다9,10.
블라g 1은 곤충 주요 알레르겐(MA) 단백질 패밀리의 프로토타입 멤버를 나타내며, 비정상적으로 큰 소수성 충치9,11을둘러싸는 12개의 수륙양용 알파 헬기로 구성된 독특한 구조를 갖는다. 블라 g 1의 사용 가능한 X 선 결정 구조는 결합 된 인지질 또는 지방산 리간드와 일치하는이 캐비티 내의 전자 밀도를 보여줍니다. 31P-NMR 및 질량 분석법에 의해 확인된 추측. 이러한 화물은 본질적으로 이질적이었고, 이들의 조성물은 알레르겐 소스에 크게 의존했으며, 대장균과 P. 목회에서 발현된 재조합 블라 g 1을 위해 관찰된 다른 지질 프로파일이 관찰되었다. 흥미롭게도, 블라 g 1 천연 알레르겐 소스에서 정제 (바퀴벌레 frass) 그것의 결합 부위 내에서 주로 지방산을 포함, 팔미타테의 혼합물, 올레아테, 그리고 stearate의 혼합물로 식별 되는 “자연” 리간드9,11. 여러 정화 단계에 따라 지질과 지방산을 유지하는 Bla g 1의 능력은 격리된 단백질을 연구하는 노력을 방해합니다. 반대로, 블라g 1의 천연 팔미타테, 스테레이트 및 올레아테 리간드가 알레르기성 및 토착 생물학적 기능9모두에서 핵심적인 역할을 한다는 것이 제안되고 있다. 그러나, 이러한 리간즈는 재조합 소스에서 얻은 블라 g 1에 존재하지 않으며, 이 가설을 평가하기 어렵게 만듭니다. Bet v112,13과같은 다른 지질 결합 알레르겐에 대해도 유사한 문제가 관찰되고 있다. 지질 알레르겐 상호 작용의 체계적인 연구를 용이하게하기 위해 우리는 알레르겐이 내인성 바운드 지질을 정량적으로 제거하고 아포 형태로 재구성하거나 특정 리간드로로드 할 수있는 프로토콜을 개발했습니다.
알레르겐은 친화성 크로마토그래피 및/또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 자연 또는 재조합 소스에서 가장 일반적으로 정제됩니다. 여기서, 알러지 유발 물질이 지방산 결합단백질(14)에대해 개발된 프로토콜과 유사한 유기 용매로 용출되는 역상 C18 컬럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 형태로 추가 정화 단계를 소개한다. 결과 단백질은 지방산 및/또는 인지질의 부재 또는 존재에 있는 열 어닐링 단계를 복종합니다. 네이티브 Bla g 1 접기를 복구하는 것 외에도, 높은 온도는 지질 화물의 용해도및 접근성을 증가시키고, 아포 형태로 블라 g 1을 산출하거나 원하는 소수성 리간드로 균일하게 로드됩니다. 31 이러한 방식으로 정제된 블라g 1의 P-NMR 스펙트럼은 원하는 화합물과 내인성 바운드 리간드와 균일한 교체의 완전한 제거를 확인했으며, 원형 이색증은 블라 g 1 폴드의 성공적인 회복을 확인하였다. 이 방법의 유용성은 A9 g 1 열안정성 및 보철 저항을 향상시키는 화물 결합이 발견된 최근 작업에서 강조되어 T 세포 에피토프 생성의 운동학을 민감화 및 알레르기성9에대한 잠재적 인 의미로 변경합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품에 기재된 프로토콜은 블라g 1의 지질 결합 특성을 체계적으로 연구하기 위해 성공적으로 적용되었다. 이는 화물 결합, 열안정성 및 내구 처리 사이의 상관관계를 드러냈으며, 후자는 면역원성9,18에대한 잠재적 의미와 알려진 T세포 에피토프의 생성 감소와 상관관계가 있었다. 블라 g 1 외에도, Pru p 3 및 Bet v 1과 같은 다른 알레르겐은 표준 친화성…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 톰 커비 박사, 스콧 가벨, 그리고 로버트 런던 박사의 도움과 도움에 감사드리며, 밥 페트로비치 박사와 로리 에드워즈 박사와 함께 이 연구에서 사용되는 Bla g 1 구체를 생성하는 데 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 우리는 질량 분석에 대한 안드레아 아담스와 NMR 계측에 대한 지원을 유진 DeRose 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다, 환경 보건 과학의 국립 연구소, Z01-ES102906 (GAM). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 환경 보건 과학 연구소의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
Referências
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