वयस्क माउस अंडाशय में सटीक कूप गणना
Summary
यहां, हम निश्चित माउस अंडाशय ऊतकों की सटीक कूप गिनती के लिए दो अलग-अलग तकनीकों का वर्णन, तुलना और इसके विपरीत करते हैं।
Abstract
यौन प्रजनन महिला स्तनधारियों oocytes के अपने पूरे जीवन काल की आपूर्ति के साथ पैदा होते हैं । अपरिपक्व, शांत ओसाइट्स मौलिक रोम के भीतर पाए जाते हैं, जो मादा जर्मलाइन की भंडारण इकाई है। वे गैर अक्षय हैं, इस प्रकार जन्म पर उनकी संख्या और नुकसान की बाद की दर काफी हद तक महिला उपजाऊ उम्र तय करती है । अंडाशय रिजर्व पर दवाओं और विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए महिलाओं और जानवरों में मौलिक कूप संख्या का सटीक मात्राकरण आवश्यक है। यह भी की जरूरत है, और की सफलता, मौजूदा और उभरती प्रजनन संरक्षण तकनीकों के मूल्यांकन के लिए आवश्यक है । वर्तमान में, महिलाओं में अंडाशय रिजर्व को शामिल करने वाले मौलिक रोम की संख्या को सही ढंग से मापने के लिए कोई तरीका मौजूद नहीं है। इसके अलावा, प्रयोग के लिए बड़े जानवरों या लुप्तप्राय प्रजातियों से अंडाशय ऊतक प्राप्त करना अक्सर संभव नहीं होता है। इस प्रकार, चूहों इस तरह के अध्ययनों के लिए एक आवश्यक मॉडल बन गए हैं, और पूरे माउस अंडाशय में मौलिक कूप संख्या का मूल्यांकन करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण उपकरण है। हालांकि, साहित्य में माउस अंडाशय में पूर्ण कूप संख्या की रिपोर्ट अत्यधिक चर रहे हैं, यह मुश्किल की तुलना करने के लिए और/ यह तनाव, आयु, उपचार समूहों, साथ ही नियोजित गिनती के तरीकों में तकनीकी अंतर सहित कई कारकों के कारण है । इस लेख में, हम हिस्टोलॉजिकल वर्गों को तैयार करने और दो अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके माउस अंडाशय में मौलिक रोम की गिनती के लिए एक कदम-दर-कदम अनुदेशात्मक गाइड प्रदान करते हैं: [1] स्टीरियोलॉजी, जो आंशिक/ऑप्टिकल विच्छेदन तकनीक पर निर्भर करता है; और [2] प्रत्यक्ष गिनती तकनीक। प्रत्येक विधि के कुछ प्रमुख फायदों और कमियों पर प्रकाश डाला जाएगा ताकि क्षेत्र में प्रजनन क्षमता में सुधार किया जा सके और शोधकर्ताओं को उनके अध्ययन के लिए सबसे उपयुक्त विधि का चयन करने में सक्षम बनाया जा सके ।
Introduction
अपरिपक्व, meiotically-अंडाशय में मौलिक रोम के भीतर संग्रहीत oocytes गिरफ्तार महिला जर्मलाइन के लिए भंडारण इकाई है और एक व्यक्ति के जीवन भर अंडाशय रिजर्व शामिल हैं । मौलिक कूप संख्या1वर्ष की आयु के साथ स्वाभाविक रूप से गिरावट आती है, या वैकल्पिक रूप से, हवा, भोजन और पानी2में कुछ फार्मास्यूटिकल्स और पर्यावरण विषाक्त पदार्थों सहित बहिर्जात रसायनों के संपर्क में आने के बाद समय से पहले समाप्त हो सकती है। यह देखते हुए कि मौलिक कूप संख्या परिमित है, अंडाशय के भीतर मौजूद रोम की मात्रा और गुणवत्ता काफी हद तक महिला प्रजनन क्षमता और संतानों के स्वास्थ्य को निर्धारित करती है। इस प्रकार, अंडाशय रिजर्व पर बहिर्जात अपमान के ऑफ-टारगेट प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए महिलाओं में मौलिक कूप संख्या का सटीक मात्राकरण आवश्यक है।
महिलाओं में, पूरे अंडाशय का विश्लेषण आम तौर पर संभव नहीं है, इस प्रकार अंडाशय रिजर्व के गैर-आक्रामक सरोगेट उपायों का उपयोग नैदानिक सेटिंग में किया जाना चाहिए। एंटी-Mϋllerian हार्मोन (एएमएच) सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला सरोगेट बायोमार्कर चिकित्सकीय रूप से3है। सीरम AMH स्तर अक्सर उन्नत मातृ आयु की महिलाओं में मापा जाता है, या पहले और कैंसर के इलाज के बाद, जैसे कीमोथेरेपी । हालांकि, एएमएच का उत्पादन रोम बढ़ने से होता है न कि मौलिक रोम द्वारा, और इस प्रकार, सीरम का स्तर पूर्ण मौलिक कूप संख्या पर सूचित नहीं करता है।
सीटूमें महिलाओं में मौलिक कूप संख्या को सही ढंग से निर्धारित करने के तरीकों के अभाव के साथ, छोटे पशु मॉडलों में अंडाशय के रोम की गिनती, जैसे कृंतक, उस डिग्री का आकलन करने के लिए एक आवश्यक अनुसंधान उपकरण बना हुआ है जिसके द्वारा बहिर्जात अपमान मौलिक रोम पर प्रभाव डालता है और इस प्रकार, प्रजनन क्षमता। दुर्भाग्य से, कृंतक मॉडल में मौलिक कूप संख्या के साहित्य भर में रिपोर्ट अत्यधिक चर4हैं । इस के लिए एक प्रमुख कारण व्यापक रूप से नियोजित गिनती विधि में तकनीकी मतभेदों की सूचना दी है । मुख्य रूप से, चूहों में मौलिक रोम की गणना के लिए साहित्य में दो अलग-अलग तकनीकों का वर्णन किया गया है। इनमें स्टीरियोलॉजी शामिल है, जो आंशिक ऑप्टिकल विच्छेदन विधि को नियोजित करता है, और प्रत्यक्ष कूप मायने रखता है।
स्टीरियोलॉजी को व्यापक रूप से सोने के मानक माना जाता है क्योंकि यह व्यवस्थित समान यादृच्छिक नमूना5का उपयोग करता है, जिससे यह पूरे माउस में मौलिक कूपसंख्या, या चूहे के अंडाशय4,6,7में मात्रा निर्धारित करने की सबसे सटीक विधि है। स्टीरियोलॉजी निष्पक्ष है, क्योंकि यह ब्याज8की वस्तु की त्रि-आयामी संरचना के लिए खाता है। एक ऑप्टिकल विच्छेदन/अंश विधि का उपयोग करके, नमूने के तीन स्तरों को कुल माउस अंडाशय के एक ज्ञात अंश के भीतर मोटी ऊतक वर्गों (जैसे, 20 माइक्रोन) का उपयोग करके मौलिक रोम की मात्रा निर्धारित करने के लिए लागू किया जाता है। सबसे पहले, नमूना अंतराल को यादृच्छिक शुरुआत (नमूना अंश 1, एफ1)4 पर (उदाहरण केलिए, हर 3 अनुभाग) चुनाजाताहै। धाराओं तो पूरे अंडाशय के माध्यम से इस बिंदु से एक व्यवस्थित, एक समान तरीके से नमूना कर रहे हैं । फिर, एक निष्पक्ष गिनती फ्रेम अंडाशय अनुभाग पर आरोपित है और उत्तरोत्तर एक परिभाषित, यादृच्छिक गिनती ग्रिड (नमूना अंश 2, एफ2)8के साथ चला गया है । अंत में, खंड मोटाई का एक ज्ञात अंश ऑप्टिकल रूप से नमूना है (उदाहरण के लिए, 10 माइक्रोन) और इस क्षेत्र के भीतर रोम (नमूना अंश 3, एफ3)4)गिना जाता है। कच्चे कूप संख्या अंतिम मूल्य प्राप्त करने के लिए इन नमूना अंशों के विलोम से गुणा किया जाता है। इस विधि के लिए विशेषज्ञ प्रशिक्षण और उपकरणों की आवश्यकता होती है, जिसमें स्टीरियोलॉजिकल सॉफ्टवेयर द्वारा संचालित मोटरचालित चरण के साथ एक माइक्रोस्कोप शामिल है। ऊतकों को एक विशेष बोइन के फिक्सेटिव में संरक्षित किया जाना चाहिए, और ग्लाइकोलेथाक्रिएलेट राल में एम्बेडेड किया जाना चाहिए ताकि मोटी ऊतक वर्गों को कांच के चाकू के साथ ग्लाइकोलेथाक्र्रेल राल माइक्रोटॉम का उपयोग करके काटा जा सके। इस विधि को ऊतक सिकुड़न और विरूपण के लिए खाते में डिज़ाइन किया गया है, ताकि अंडाशय और रोम 9 की त्रि-आयामी रूपात्मक संरचना को सबसे अच्छासंरक्षितकिया जा सके।
10कूपों की गणना के लिए प्रत्यक्ष कूप गणना सबसे अधिक बार उपयोग की जाने वाली विधि है । अधिक आम फिक्सेटिव्स (यानी, फॉर्मेलिन) का उपयोग किया जा सकता है, इसके बाद पैराफिन वैक्स एम्बेडिंग और संपूर्ण धारावाहिक अनुभागिंग के बीच 4-6 माइक्रोम की मोटाई पर एक मानक माइक्रोटॉम का उपयोग करके। रोम व्यवस्थित रूप से एक निर्धारित अंतराल पर पूरे ऊतक अनुभाग में गिना जाता है, और फिर कुल कूप अनुमान प्राप्त करने के लिए नमूना अंतराल के विपरीत से गुणा किया जाता है। यह विधि त्वरित, आसान है, संग्रहीत ऊतकों का उपयोग करके किया जा सकता है, और मानक हिस्टोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है। इसके लिए मानक इमेजिंग क्षमताओं के साथ केवल एक हल्के माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। हालांकि, इन फायदों के बावजूद, प्रत्यक्ष कूप गिनती सटीकता और स्टीरियोलॉजी के सख्त गिनती मापदंडों का अभाव है, यह अधिक अन्वेषक पूर्वाग्रह के लिए प्रवण बना रही है । इसके अतिरिक्त, ऊतकों को प्रसंस्करण के दौरान सिकुड़न और विरूपण से गुजरना पड़ सकता है, अंडाशय की अखंडता और आकृति विज्ञान को बाधित किया जा सकता है और इस प्रकार कूप वर्गीकरण और मात्राकरण को मुश्किल बना सकता है।
इस लेख का उद्देश्य माउस अंडाशय में मौलिक कूप संख्या का मात्रात्मक रूप से आकलन करने के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दो तरीकों का वर्णन करना है: स्टीरियोलॉजी और प्रत्यक्ष कूप गिनती। हम इन दो तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करेंगे और उनकी कुछ ताकतों और कमजोरियों को उजागर करेंगे, ताकि हमारे क्षेत्र में प्रजनन क्षमता को बढ़ाया जा सके और शोधकर्ताओं को उनके अध्ययन के लिए सबसे उपयुक्त गिनती विधि का एक सूचित निर्णय लेने की अनुमति दी जा सके ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख माउस मौलिक रोम, स्टीरियोलॉजी, और प्रत्यक्ष कूप गिनती की अधिक सामान्य रूप से नियोजित विधि की गणना के लिए सोने के मानक तकनीक के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है। कीमोथेरेपी उपचार का उपयोग…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम विक्टोरियन राज्य सरकार परिचालन बुनियादी ढांचे के समर्थन और ऑस्ट्रेलियाई सरकार NHMRC IRIISS के माध्यम से संभव बनाया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (ALW #1120300) और ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (KJH #FT190100265) से धन द्वारा समर्थित । लेखक मोनाश एनिमल रिसर्च प्लेटफॉर्म, मोनाश हिस्टोलॉजी प्लेटफॉर्म और मोनाश माइक्रो इमेजिंग फैसिलिटी की तकनीकी मदद को स्वीकार करना चाहेंगे ।
Materials
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
Referências
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