成人マウス卵巣における正確な卵胞列挙体
Summary
ここでは、固定マウス卵巣組織の正確な卵胞数を計算するための2つの異なる技術について説明し、比較し、対比する。
Abstract
性的に再生する女性の哺乳類は、卵母細胞の生涯供給で生まれます。未熟な静止卵母細胞は、原始卵胞、女性生殖細胞の貯蔵単位内で発見される。彼らは再生不可能であるため、出生時の数とその後の損失率は、主に女性の肥沃な寿命を決定します。女性および動物における原始卵数の正確な定量は、卵巣予備軍に対する医薬品および毒性物質の影響を決定するために不可欠である。また、既存および新興の不妊治療保存技術の必要性と成功を評価する必要があります。現在、女性における卵巣予備を含む原胞の数を正確に測定する方法は存在しない。さらに、実験のために大型動物や絶滅危惧種から卵巣組織を得ることは、しばしば実現不可能である。このように、マウスはこのような研究に不可欠なモデルとなっており、マウスの卵巣全体で原胞数を評価する能力は重要なツールです。しかし、文献中のマウス卵巣の絶対卵胞数の報告は非常に変動するため、データの比較や複製が困難です。これは、株、年齢、治療群、および採用されたカウント方法の技術的な違いを含む多くの要因によるものです。本稿では、分数/光学解離技術に依存する[1]ステレロジーという2つの異なる方法を用いて、組織学的セクションを準備し、マウス卵巣の原始卵胞を数えるステップバイステップの指導ガイドを提供します。そして[2]直接カウント技術。各方法の主な利点と欠点のいくつかは、現場で再現性を向上させ、研究者が研究に最も適した方法を選択できるように強調されます。
Introduction
卵巣の原始卵胞内に貯蔵された未熟で、機始的に逮捕された卵母細胞は、女性生殖細胞系列の貯蔵単位であり、個人の生涯卵巣予備軍を構成する。原胞の数は、1歳とともに自然に減少し、あるいはあるいは、空気中のいくつかの医薬品および環境毒性物質を含む外因性化学物質への暴露後に早期に枯渇する可能性がある2。原始卵胞数が有限であることを考えると、卵巣内に存在する卵胞の量と質は、主に女性の生殖能力と子孫の健康を決定する。したがって、女性における原始卵胞数の正確な定量化は、卵巣予備軍に対する外因性侮辱のオフターゲットの影響を評価するために不可欠である。
女性では、卵巣全体の分析は一般的に不可能であり、したがって卵巣予備の非侵襲的代理手段は臨床現場で利用されなければならない。抗Mϋllerianホルモン(AMH)は、臨床的に最も広く使用されている代理バイオマーカーです。血清AMHレベルは、多くの場合、進行した母親の年齢の女性、または化学療法などの癌治療の前後に測定されます。しかし、AMHは原始卵胞ではなく卵胞を成長させることによって産生され、したがって、血清レベルは絶対的な原始卵胞数では知らない。
げっ歯類などの小動物モデルの卵巣卵胞を数える その場の女性の原始卵胞数を正確に決定する方法がないため、外因性の侮辱が原始卵胞に与える程度を評価し、生殖能力を評価するために不可欠な研究ツールであり続ける。残念ながら、げっ歯類モデルにおける原始卵胞数の文献全体の報告は非常に可変的です 4.この主な理由は、採用されたカウント方法の技術的な違いが広く報告されている。主に、マウスの原胞を列挙するための文献に記載されている2つの異なる技術がある。これらには、分数光学解質法を採用するステレロジー、および直接卵胞数が含まれる。
ステレロジーは、体系的な均一なランダムサンプリング5を使用し、マウス全体で原始卵数を定量する最も正確な方法、またはラット卵巣4、6、7を使用するため、金本位制と広く考えられている。ステレロジーは、対象物8の立体構造を占めているため、公平である。光学脱離/分化法を用いて、3段階のサンプリングを適用して、マウス総卵巣の既知の分数内で厚い組織切片(例えば20μm)を使用して原胞を定量化する。まず、サンプリング間隔がランダムな開始(サンプリング分1、f1)4で選択されます(例えば、3番目のセクションごと)。その後、セクションは、この時点から卵巣全体を通して体系的で均一な方法でサンプリングされる。次に、バイアスされない計数フレームが卵巣セクションの上に重ね合わされ、定義されたランダム化されたカウントグリッド(サンプリング分数2、f2)8に沿って徐々に移動する。最後に、断面厚さの既知の分率は光学的にサンプリングされ(例えば、10μm)、この領域内の卵胞は計数される(サンプリング分画3、f3)4。生の卵胞数は、最終的な値を得るために、これらのサンプリング分数の逆数で乗算されます。この方法では、ステレオロジーソフトウェアによって駆動される電動ステージを備えた顕微鏡を含む専門家の訓練と機器が必要です。組織は特殊なブインの固定液に保存し、グリコールメタクリレート樹脂に埋め込まれ、ガラスナイフを用いたグリコールメタクリレート樹脂ミクロトームを使用して厚い組織切片を切断できるようにする必要があります。この方法は、組織の収縮および変形を考慮して設計されており、卵巣および卵胞9の三次元形態構造を最もよく保存する。
直接卵胞カウントは、卵胞10を数える最も頻繁に使用される方法です。より一般的な固定剤(すなわち、ホルマリン)を使用することができ、その後に4〜6μmの厚さの標準ミクロトームを使用してパラフィンワックス埋め込みおよび網羅的なシリアル切除が行われる。卵胞は、定義された間隔で組織セクション全体で体系的にカウントされ、次にサンプリング間隔の逆数を掛けて全卵胞の推定値を得る。この方法は、迅速かつ容易に、アーカイブされた組織を使用して行うことができる、および標準的な組織学的手法を使用して調製される。それは標準的なイメージ投射機能の軽い顕微鏡だけ要求する。しかし、これらの利点にもかかわらず、直接卵胞カウントはステレロジーの精度と厳格なカウントパラメータを欠いているため、研究者の偏見が強くなります。さらに、組織は処理中に収縮および変形を受け、卵巣の完全性および形態を破壊し、卵胞の分類および定量化を困難にする。
この記事の目的は、マウス卵巣の原始卵胞数を定量的に評価するために一般的に使用される2つの方法を説明することです: 生殖器と直接卵胞の数え。我々は、これらの2つの方法の詳細なプロトコルを提供し、我々の分野で再現性を高め、研究者が彼らの研究のための最も適切なカウント方法の情報に基づいた決定を行うことを可能にするために、それらの長所と短所のいくつかを強調する。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、マウスの原始卵胞、ステテロロジー、および直接卵胞の数え方がより一般的に採用される方法を列挙するためのゴールドスタンダード技術のステップバイステッププロトコルを提供します。化学療法治療は、同じ動物から左右の卵巣内のこれら2つの異なる方法から得られた結果を比較対照するために使用した。どちらの方法も、原始卵胞数における高い動物間変動性を明らか…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、ビクトリア州政府の運用インフラ支援とオーストラリア政府NHMRC IRIISSを通じて可能となり、国民保健医療研究評議会(ALW#1120300)とオーストラリア研究評議会(KJH#FT190100265)からの資金提供によって支援されました。著者らは、モナッシュ動物研究プラットフォーム、モナッシュ菌学プラットフォーム、モナッシュマイクロイメージング施設の技術サポートを認めたい。
Materials
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
Referências
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