Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.
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Artigo de método
Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os cânceres colorretais são caracterizados pela heterogeneidade e uma organização hierárquica composta por uma população de células-tronco cancerígenas (CSCs) responsáveis pelo desenvolvimento do tumor, manutenção e resistência aos fármacos. Uma melhor compreensão das propriedades do CSC para seu direcionamento específico é, portanto, um pré-requisito para uma terapia eficaz. No entanto, há uma escassez de modelos pré-clínicos adequados para investigações aprofundadas. Embora as linhas de células cancerígenas in vitro bidimensionais (2D) forneçam insights valiosos sobre a biologia tumoral, elas não replicam a heterogeneidade fenotípica e genética do tumor. Em contraste, modelos tridimensionais (3D) abordam e reproduzem a complexidade do câncer quase fisiológico e a heterogeneidade celular. O objetivo deste trabalho foi projetar um sistema de cultura 3D robusto e reprodutível para estudar biologia CSC. A presente metodologia descreve o desenvolvimento e otimização das condições para a geração de esferoides 3D, que são homogêneos em tamanho, a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2, modelo que pode ser utilizado para a cultura de longo prazo. É importante ressaltar que, dentro dos esferoides, as células que se organizavam em torno de estruturas semelhantes ao lúmen, foram caracterizadas por padrões diferenciais de proliferação celular e pela presença de CSCs expressando um painel de marcadores. Esses resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação desta abordagem 3D para estudar heterogeneidade celular e biologia CSC, incluindo a resposta à quimioterapia.
Introdução
O câncer colorretal (CRC) continua sendo a segunda principal causa de mortes associadas ao câncer no mundo1. O desenvolvimento do CRC é resultado de uma progressiva aquisição e acúmulo de mutações genéticas e/ou alterações epigenéticas2,3, incluindo a ativação de oncogenes e a inativação dos genes supressores tumorais3,4. Além disso, fatores não genéticos (por exemplo, o microambiente) podem contribuir e promover a transformação oncogênica e, assim, participar da evolução dos CRCs5. É importante ressaltar....
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Protocolo
NOTA: Os detalhes de todos os reagentes e materiais estão listados na Tabela de Materiais.
1. Formação esferoide
- Mídia de cultura esféide
- Prepare o meio basal composto pelo DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco, complementado com dipeptida l-alanyl-L-glutamina de 4 mM.
- Prepare o MDM MÉDIO completo contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina (Pen/Estreptomicina) em meio basal a partir da etapa 1.1.1.
- Prepare o meio da matriz de membrana DMEM/porão contendo matriz de membrana de 2,5% no porão, 10% FBS e 1% Caneta/Estreptococos em m....
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Resultados
Como a falta de homogeneidade no tamanho dos esferoides é uma das principais desvantagens dos sistemas de cultura 3D3D 13disponíveis atualmente, o objetivo deste trabalho foi criar um protocolo confiável e reprodutível para obter spheroids homogêneos. Primeiro, para estabelecer condições ideais de trabalho, foram testados diferentes números de células Caco2, variando de 50 a 2.000 células por microwell/esferoide utilizando placas dedicadas(Tabela 1.......
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Discussão
Modelos 3D in vitro superam as principais desvantagens experimentais das culturas de células cancerígenas 2D, pois parecem ser mais confiáveis na recapitulação de características tumorais típicas, incluindo microambiente e heterogeneidade celular. Modelos 3D comumente usados de esferoides são livres de andaimes (cultivados em condições de baixa fixação) ou baseados em andaimes (usando biomateriais para células de cultura). Esses métodos apresentam diferentes desvantagens, pois dependem da natureza do andaime utilizado ou.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar
Agradecimentos
Reconhecemos as plataformas de histologia de recherche de imagem e anipath (CRCL, CLB). Estamos em dívida com a farmácia do Hospital Centro Léon Bérard (CLB) pelo tipo presente do FOLFOX e FOLFIRI. Agradecemos também a Brigitte Manship pela leitura crítica do manuscrito. A obra contou com o apoio da FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) e do Inca (PLBIO19-289). A MVG e a LC receberam apoio da FRM e cf recebeu apoio da fundação ARC e do Centro Léon Bérard.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 37 µ m Peneira Reversível, Grande | STEMCELL Technologies | 27250 | Para ser usado com tubos cônicos de 50 mL |
| 5-Fluorouracil | Presente da Farmácia do Centro Leon Berard (CLB) | - | solução estoque, 5 mg/100 mL; concentração final, 50 µ g/mL |
| de agarose | Placas Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 de 24 poços | STEMCELL Technologies | 34411 | 1.200 micropoços por poço para formação e crescimento de esferóides |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | diluição 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rato | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | diluição 1:500 |
| Solução de Enxágue Anti-Aderência x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rato | Invitrogen | 14-133-82 | diluição 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | diluição 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | diluição 1:1000 |
| Anti-β-catenina - Rato | Santa Cruz Biotecnologia | sc-7963 | diluição 1:50 |
| Preto placas multipoços | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Ácido Cítrico Monohidratado | Sigma | C1909 | |
| Aparelho CLARIOstar | Leitor de microplacas | BMG Labtech | |
| Caneta | marcadora Dako para marcar círculos em slides para criar barreiras para líquidos | ||
| Anticorpo Secundário IgG (H+L) Anticorpo Secundário Anti-Mouse anti-Mouse Donkey, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | diluição 1:1000 |
| Anticorpo Secundário IgG (H+L) Anticorpo Secundário Anti-Mouse anti-Mouse Donkey, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | diluição 1:1000 |
| Anticorpo secundário altamente adsorvido anti-coelho IgG (H+L) anticorpo secundário altamente adsorvido de burro, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | diluição 1:1000 |
| Anticorpo secundário altamente adsorvido anti-coelho de burro (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | diluição 1:1000 |
| Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) Glutamax (dipeptídeo L-alanil-L-glutamina) | Gibco | 10569010 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel meio de montagem com DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Anticorpo Secundário de Adição Cruzada de IgG (H+L) de Cabra Anti-Adsorvido, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | diluição 1:1000 |
| Software | Análise de imagem de esferóide | ||
| Irinotecan& nbsp; | Presente da Farmácia | CLB-solução | estoque, 20 mg / mL; concentração final, 100 µ g/mL |
| de transcriptase reversa iScript | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorina | Presente de Farmácia CLB-estoque | solução, 50 mg / mL; concentração final, 25 µ g/mL | |
| Matriz de Membrana Embasável Matrigel | Corning | 354234 | Matriz de Membrana Embasada |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatina | Presente de Farmácia CLB-solução | estoque, 100 mg/20 mL;concentração final, 10 µ g/mL | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140130 | |
| Tampão de fosfato salino (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Verde | Thermo Fisher Scientific | S7020 | coloração de ácido nucleico; diluição 1:5000 |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Gibco | ||
| microscópio Zeiss-Axiovert | invertido para aquisição de imagens de esferoides |
Referências
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B.
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Reimpressões e permissões
