Un modèle tridimensionnel des sphéroïdes pour étudier les cellules souches du cancer du côlon

Summary

Ce protocole présente un système original, robuste, et reproductible de culture pour générer et faire croître les sphéroïdes tridimensionnels des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points. Les résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche pour étudier la biologie des cellules souches cancéreuses, y compris la réponse à la chimiothérapie.

Abstract

Les cancers colorectaux sont caractérisés par une hétérogénéité et une organisation hiérarchique comprenant une population de cellules souches cancéreuses (CSC) responsables du développement tumoral, de l’entretien et de la résistance aux médicaments. Une meilleure compréhension des propriétés du SCC pour leur ciblage spécifique est donc une condition préalable à l’efficacité d’un traitement. Cependant, il y a un manque de modèles précliniques appropriés pour des enquêtes approfondies. Bien que les variétés de cellule bidimensionnelles in vitro de cancer (2D) fournissent des aperçus valables dans la biologie de tumeur, elles ne répliquent pas l’hétérogénéité phénotypique et génétique de tumeur. En revanche, les modèles tridimensionnels (3D) abordent et reproduisent la complexité quasi physiologique du cancer et l’hétérogénéité cellulaire. L’objectif de ces travaux était de concevoir un système de culture 3D robuste et reproductible pour étudier la biologie du CSC. La méthodologie actuelle décrit le développement et l’optimisation des conditions pour générer des sphéroïdes 3D, qui sont homogènes dans la taille, des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points, un modèle qui peut être employé pour la culture à long terme. D’une manière primordiale, dans les sphéroïdes, les cellules qui ont été organisées autour de lumen-comme des structures, ont été caractérisées par des modèles différentiels de prolifération cellulaire et par la présence de CSCs exprimant un panneau de marqueurs. Ces résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche 3D pour étudier l’hétérogénéité cellulaire et la biologie du CSC, y compris la réponse à la chimiothérapie.

Introduction

Le cancer colorectal (CCR) reste la deuxième cause de décès associés au cancer dans le monde¹. Le développement du CRC est le résultat d’une acquisition et d’une accumulation progressives de mutations génétiques et/ou d’altérations épigénétiques^2,3,notamment l’activation d’oncogènes et l’inactivation de gènes suppresseurs de^{tumeurs 3,4.} De plus, des facteurs non génétiques (p. ex. le microenvironnement) peuvent contribuer à la transformation oncogène et la promouvoir, et ainsi participer à l’évolution des CRC^5. Il est important de faire en sorte que les CRC soient composés de différentes populations cellulaires, notamment de CSC indifférenciés et de cellules tumorales en vrac présentant certains traits de différenciation, qui constituent une structure hiérarchique rappelant l’organisation de l’épithélium dans une crypte normale du côlon^6,7.

Les CSC sont considérés comme responsables de l’aspect tumoral^8,de son maintien et de sa croissance, de sa capacité métastatique et de sa résistance aux thérapies conventionnelles^6,7. Dans les tumeurs, les cellules cancéreuses, y compris les CSC, présentent un niveau élevé d’hétérogénéité et de complexité en termes de profils mutationnels et épigénétiques distincts, de différences morphologiques et phénotypiques, d’expression génique, de métabolisme, de taux de prolifération et de potentiel métastatique^9. Par conséquent, pour mieux comprendre la biologie du cancer, la progression tumorale et l’acquisition de la résistance à la thérapie et sa traduction en traitements efficaces, les modèles précliniques humains capturant cette hétérogénéité et cette hiérarchie du cancer sont importants^10,11.

Les lignées cellulaires in vitro du cancer 2D sont utilisées depuis longtemps et fournissent des informations précieuses sur le développement tumoral et les mécanismes sous-jacents à l’efficacité des molécules thérapeutiques. Cependant, leur limitation en ce qui concerne l’absence de l’hétérogénéité phénotypique et génétique trouvée dans les tumeurs originales est maintenant largement reconnue^12. De plus, les nutriments, l’oxygène, les gradients de pH et le microenvironnement tumoral ne sont pas reproduits, le microenvironnement étant particulièrement important pour le maintien des différents types de cellules, y compris les CSC^11,12. Pour surmonter ces principaux inconvénients, plusieurs modèles 3D ont été développés pour traiter et reproduire expérimentalement la complexité et l’hétérogénéité des cancers. En effet, ces modèles récapitulent l’hétérogénéité cellulaire tumorale, les interactions cellule-cellule, et l’architecture spatiale, semblables à celles observées in vivo^12,13,14. Les organoïdes tumoraux primaires établis à partir de tumeurs fraîches, ainsi que des sphéroïdes dérivés de la lignée cellulaire, sont largement employés^15,16.

Les sphéroïdes peuvent être cultivés d’une manière sans échafaudage ou basée sur l’échafaudage pour forcer les cellules à se former et à se développer dans des agrégats cellulaires. Les méthodes sans échafaudage sont basées sur la culture de cellules dans des conditions non adhérentes (par exemple, la méthode de suspension-goutte ou les plaques de fixation ultra-basses), tandis que les modèles à base d’échafaudages reposent sur des biomatériaux naturels, synthétiques ou hybrides pour les cellules de culture^12,13,14. Les sphéroïdes à base d’échafaudage présentent différents inconvénients car la formation finale des sphéroïdes dépendra de la nature et de la composition du (bio)matériau utilisé. Bien que les méthodes de sphéroïdes sans échafaudage disponibles jusqu’à présent ne reposent pas sur la nature du substrat, elles génèrent des sphéroïdes dont la structure et la taille^{varient 17,18.}

Ce travail visait à concevoir un système de culture 3D robuste et reproductible d’asphéroïdes, de taille homogène, composé de cellules d’adénocarcinome du côlon Caco2 pour étudier la biologie du CSC. Les cellules Caco2 présentent un intérêt particulier en raison de leur capacité à se différencier au fil du temps^19,20,suggérant fortement un potentiel de type radical. En conséquence, la culture à long terme des sphéroïdes a indiqué la présence de différentes populations de CSC avec différentes réponses à la chimiothérapie.

Protocol

REMARQUE : Les détails de tous les réactifs et matériaux sont répertoriés dans la table des matériaux. 1. Formation de sphéroïdes Milieux de culture sphéroïdes Préparer un milieu basal composé du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par un dipeptide L-alanyl-L-glutamine de 4 mM. Préparer le milieu complet DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (Pen/Strep) en milieu basal à …

Representative Results

Comme le manque d’homogénéité dans la taille des sphéroïdes est l’un des principaux inconvénients des systèmes de culture sphéroïde 3D actuellement disponibles13,le but de ce travail était de mettre en place un protocole fiable et reproductible pour obtenir des sphéroïdes homogènes. Tout d’abord, pour établir des conditions de travail idéales, différents nombres de cellules Caco2 ont été testés, allant de 50 à 2 000 cellules par microwell …

Discussion

Les modèles 3D in vitro surmontent les principaux inconvénients expérimentaux des cultures de cellules cancéreuses 2D, car ils semblent être plus fiables pour récapituler les caractéristiques tumorales typiques, y compris le microenvironnement et l’hétérogénéité cellulaire. Les modèles 3D couramment utilisés de sphéroïdes sont sans échafaudage (cultivés dans des conditions de faible fixation) ou à base d’échafaudage (en utilisant des biomatériaux pour faire culturer des cellules). Ces méthodes p…

Materials

37 µm Reversible Strainer, Large	STEMCELL Technologies	27250	To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil	Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)	–	stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24-well plates	STEMCELL Technologies	34411	1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 – Rabbit	Cell Signaling	9661	dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) – Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) – Rat	Invitrogen	14-133-82	dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	dilution 1:2000
Anti-PCNA – Mouse	Dako	M0879	dilution 1:1000
Anti-β-catenin – Mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilution 1:50
Black multiwell plates	Thermo Fisher Scientific	237108
Citric Acid Monohydrate	Sigma	C1909
CLARIOstar apparatus	BMG Labtech		microplate reader
Dako pen			marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI	Interchim	FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	dilution 1:1000
ImageJ software			Spheroid image analysis
Irinotecan	Gift from Pharmacy CLB	–	stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift from Pharmacy CLB	–	stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatin	Gift from Pharmacy CLB	–	stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)	Gibco	25300062
Zeiss-Axiovert microscope			inverted microscope for acquiring images of spheroids