Un modello tridimensionale di sferoidi per studiare le cellule staminali del cancro del colon

Summary

Questo protocollo presenta un nuovo sistema di coltura robusto e riproducibile per generare e far crescere sferoidi tridimensionali dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2. I risultati forniscono la prima prova di concetto per l’appropriatezza di questo approccio allo studio della biologia delle cellule staminali tumorali, compresa la risposta alla chemioterapia.

Abstract

I tumori colorettali sono caratterizzati da eterogeneità e da un’organizzazione gerarchica che comprende una popolazione di cellule staminali tumorali (CSC) responsabili dello sviluppo, del mantenimento e della resistenza ai farmaci del tumore. Una migliore comprensione delle proprietà CSC per il loro targeting specifico è, quindi, un prerequisito per una terapia efficace. Tuttavia, vi è una scarsità di modelli preclinici adatti per indagini approfondite. Sebbene le linee cellulari tumorali bidimensionali (2D) in vitro forniscano preziose informazioni sulla biologia tumorale, non replicano l’eterogeneità fenotipico e genetico del tumore. Al contrario, i modelli tridimensionali (3D) affrontano e riproducono la complessità quasi fisiologica del cancro e l’eterogeneità cellulare. Lo scopo di questo lavoro era quello di progettare un sistema di coltura 3D robusto e riproducibile per studiare la biologia CSC. La presente metodologia descrive lo sviluppo e l’ottimizzazione delle condizioni per generare sferoidi 3D, di dimensioni omogenee, dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2, un modello che può essere utilizzato per la coltura a lungo termine. È importante sottolineare che, all’interno degli sferoidi, le cellule che erano organizzate attorno a strutture simili a lume, erano caratterizzate da schemi di proliferazione cellulare differenziale e dalla presenza di CSC che esprimevano un pannello di marcatori. Questi risultati forniscono la prima prova del concetto per l’appropriatezza di questo approccio 3D allo studio dell’eterogeneità cellulare e della biologia CSC, inclusa la risposta alla chemioterapia.

Introduction

Il cancro del colon-retto (CRC) rimane la seconda causa principale di decessi associati al cancro nel mondo¹. Lo sviluppo del CRC è il risultato di una progressiva acquisizione e accumulo di mutazioni genetiche e/o alterazioni epigenetiche^2,3,compresa l’attivazione di oncogeni e l’inattivazione dei geni soppressori del tumore^3,4. Inoltre, i fattori non genetici (ad esempio il microambiente) possono contribuire e promuovere la trasformazione oncogenica e quindi partecipare all’evoluzione dei^{CPC 5}. È importante sottolineare che i CPC sono composti da diverse popolazioni cellulari, tra cui CSC indifferenziati e cellule tumorali di massa che mostrano alcuni tratti di differenziazione, che costituiscono una struttura gerarchica che ricorda l’organizzazione dell’epitelio in una normale cripta del colon^6,7.

I CSC sono considerati responsabili dell’aspetto^{tumorale 8,}del suo mantenimento e crescita, della capacità metastatica e della resistenza alle terapie^{convenzionali 6,7}. All’interno dei tumori, le cellule tumorali, comprese le CSC, mostrano un alto livello di eterogeneità e complessità in termini di profili mutazionali ed epigenetici distinti, differenze morfologiche e fenotipiche, espressione genica, metabolismo, tassi di proliferazione e potenziale metastatico⁹. Pertanto, per comprendere meglio la biologia del cancro, la progressione del tumore e l’acquisizione della resistenza alla terapia e la sua traduzione in trattamenti efficaci, i modelli preclinici umani che catturano questa eterogeneità e gerarchia del cancro^{sono importanti 10,11}.

Le linee cellulari tumorali 2D in vitro sono state utilizzate per molto tempo e forniscono preziose informazioni sullo sviluppo del tumore e sui meccanismi alla base dell’efficacia delle molecole terapeutiche. Tuttavia, la loro limitazione rispetto alla mancanza di eterogeneità fenotipico e genetica riscontrata nei tumori originali è ora ampiamente^{riconosciuta 12}. Inoltre, i nutrienti, l’ossigeno, i gradienti di pH e il microambiente tumorale non vengono riprodotti, poiché il microambiente è particolarmente importante per il mantenimento di diversi tipi di cellule tra cui CSC^11,12. Per superare questi principali inconvenienti, sono stati sviluppati diversi modelli 3D per affrontare e riprodurre sperimentalmente la complessità e l’eterogeneità dei tumori. In effetti, questi modelli ricapitolano l’eterogeneità cellulare tumorale, le interazioni cellula-cellula e l’architettura spaziale, simili a quelle osservate in vivo^12,13,14. Gli organoidi tumorali primari stabiliti da tumori freschi, così come gli sferoidi derivati dalla linea cellulare, sono in gran^{parte impiegati 15,16}.

Gli sferoidi possono essere coltivati in modo privo di impalcature o impalcature per costringere le cellule a formarsi e crescere in aggregati cellulari. I metodi senza impalcature si basano sulla coltura di cellule in condizioni non aderenti (ad esempio, il metodo della caduta sospesa o piastre di fissaggio ultra-basse), mentre i modelli a base di impalcature si basano su biomateriali naturali, sintetici o ibridi per^{coltura delle celle 12,13,14}. Gli sferoidi a base di impalcature presentano diversi svantaggi in quanto la formazione finale dello sferoide dipenderà dalla natura e dalla composizione del (bio)materiale utilizzato. Sebbene i metodi sferoidi senza impalcature disponibili finora non si affidino alla natura del substrato, generano sferoidi che variano nella struttura e^{nelle dimensioni 17,18}.

Questo lavoro era finalizzato alla progettazione di un robusto e riproducibile sistema di coltura 3D di sferoidi, di dimensioni omogenee, composto da cellule adenocarcinoma del colon Caco2 per studiare la biologia CSC. Le cellule Caco2 sono di particolare interesse per la loro capacità di differenziarsi^{nel tempo 19,20}, suggerendo fortemente un potenziale simile a quello delle staminali. Di conseguenza, la cultura a lungo termine degli sferoidi ha rivelato la presenza di diverse popolazioni CSC con diverse risposte alla chemioterapia.

Protocol

NOTA: I dettagli di tutti i reagenti e materiali sono elencati nella tabella dei materiali. 1. Formazione di sferoidi Mezzi di coltura sferoide Preparare il mezzo basale costituito dal Mezzo aquila modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con dipeptide L-alanil-L-glutammina da 4 mM. Preparare il mezzo completo DMEM contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l’1% di penicillina-streptomicina (Pen/Strep) in mezzo basale a partire dal passo 1.1.1…

Representative Results

Poiché la mancanza di omogeneità nelle dimensioni degli sferoidi è uno dei principali svantaggi dei sistemi di coltura 3D sferoideattualmente disponibili 13, loscopo di questo lavoro era quello di creare un protocollo affidabile e riproducibile per ottenere sferoidi omogenei. In primo luogo, per stabilire condizioni di lavoro ideali, sono stati testati diversi numeri di cellule Caco2, che vanno da 50 a 2.000 cellule per microwell/sferoide utilizzando piastre ded…

Discussion

I modelli 3D in vitro superano i principali svantaggi sperimentali delle colture di cellule tumorali 2D, in quanto sembrano essere più affidabili nel ricapitolare le caratteristiche tumorali tipiche tra cui microambiente ed eterogeneità cellulare. I modelli 3D comunemente usati di sferoidi sono senza impalcature (coltivati in condizioni di basso attacco) o basati su impalcature (usando biomateriali per coltura di cellule). Questi metodi presentano diversi svantaggi in quanto dipendono dalla natura dell’impalcatura util…

Materials

37 µm Reversible Strainer, Large	STEMCELL Technologies	27250	To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil	Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)	–	stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24-well plates	STEMCELL Technologies	34411	1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 – Rabbit	Cell Signaling	9661	dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) – Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) – Rat	Invitrogen	14-133-82	dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	dilution 1:2000
Anti-PCNA – Mouse	Dako	M0879	dilution 1:1000
Anti-β-catenin – Mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilution 1:50
Black multiwell plates	Thermo Fisher Scientific	237108
Citric Acid Monohydrate	Sigma	C1909
CLARIOstar apparatus	BMG Labtech		microplate reader
Dako pen			marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI	Interchim	FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	dilution 1:1000
ImageJ software			Spheroid image analysis
Irinotecan	Gift from Pharmacy CLB	–	stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift from Pharmacy CLB	–	stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatin	Gift from Pharmacy CLB	–	stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)	Gibco	25300062
Zeiss-Axiovert microscope			inverted microscope for acquiring images of spheroids